病毒傳染性疾病中miRNA的調(diào)控功能及診斷效能的研究.pdf

1、本研究分為以下三個章節(jié):
　　第一章 H7N9編碼HA蛋白誘導(dǎo)的病理反應(yīng)及miRNA介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)
　　目的：研究功能性蛋白HA對機(jī)體的病理作用，并進(jìn)一步在細(xì)胞水平檢測Let-7e的表達(dá)和分析Let-7e的調(diào)控功能。
　　方法：一方面，在動物水平研究HA蛋白誘導(dǎo)的病理作用。從廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心購買六周齡的Balb/C雌性小鼠，隨機(jī)分為3組，分別是BSA、HA以及HA聯(lián)合不完全佐劑組，每組6只。分別于0周、3周進(jìn)行皮下接

2、種，二次接種2周后，稱量各組小鼠的體重，隨后取胸腺及脾臟進(jìn)行稱重。此外，取未經(jīng)處理的Balb/C雌性小鼠的脾臟，采用CCK8的方法進(jìn)行體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步了解HA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
　　另一方面，在細(xì)胞水平研究HA蛋白誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步分析Let-7e的調(diào)控功能。選取單核細(xì)胞THP-1進(jìn)行試驗(yàn)，THP-1是機(jī)體免疫防御反應(yīng)的主要細(xì)胞之一，具有趨化吞噬的功能。首先，以終濃度100ng/ml的HA蛋白加入到接種于六孔板的T

3、HP-1細(xì)胞中，分別于作用0h、2h、4h、8h、12h和24h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液;其次，以0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、200ng/ml不同濃度梯度HA刺激THP-1細(xì)胞4h后，同樣收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。此外，為進(jìn)一步了解HA的促炎效應(yīng)，聯(lián)合HA(100ng/ml)與細(xì)菌內(nèi)毒素LPS(1ng/ml)協(xié)同刺激THP-1細(xì)胞，分析炎癥情況。最后，通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默TLR4的表達(dá)后，分析Toll樣受體在HA誘導(dǎo)炎癥

4、反應(yīng)中的作用。收集的RNA樣本均保存于-70C，并利用實(shí)時定量PCR方法檢測炎癥因子包括IL1a、IL1b、IL6和TNFa的表達(dá)，以及細(xì)胞和培養(yǎng)上清液中Let-7e的豐度。測定結(jié)果使用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：體內(nèi)免疫HA可顯著促進(jìn)小鼠胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)，體外直接添加HA可顯著促進(jìn)原代培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖。此外，HA作用于THP-1細(xì)胞，分別在不同時間點(diǎn)和不同濃度梯度均可導(dǎo)致炎癥因子IL1a和IL6

5、表達(dá)顯著上調(diào)，IL1b呈微弱上調(diào)趨勢，而TNFa未見明顯的變化;HA與LPS在一定程度上具有協(xié)同促進(jìn)炎癥因子IL1a、IL1b和IL6的表達(dá)的作用。進(jìn)一步研究HA的作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)，在HA所致的炎癥過程中，Let-7e在THP-1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)顯著上升而上清中的豐度顯著下降;同時，沉默TLR4的表達(dá)，與NC對照組相比，炎癥因子IL1a、IL6和TNFa的表達(dá)下調(diào)，而細(xì)胞內(nèi)外Let-7e的表達(dá)逆轉(zhuǎn)，炎癥反應(yīng)得到一定的緩解。
　　結(jié)論：HA

6、可致小鼠機(jī)體產(chǎn)生明顯的病理反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng)。在THP-1細(xì)胞中，HA通過TLR4途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，Let-7e可能作為抑炎因子在HA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。
　　第二章 靶向流感病毒H7N9基因片段的人編碼miRNA的生物信息學(xué)分析
　　目的：在特定組織細(xì)胞中利用生物信息學(xué)預(yù)測靶向流感病毒H7N9基因片段的人編碼miRNA。
　　方法：根據(jù)miRNA直接靶向病毒RNA發(fā)揮功能的原理，基于H

7、7N9基因片段的保守性，在特定組織細(xì)胞A549中對調(diào)控H7N9基因片段的人編碼miRNA進(jìn)行預(yù)測。首先，通過序列比對軟件ClusterW2找出流感病毒H7N9基因片段(HA、NA、PB2、PA和PB1-F2)的保守區(qū);然后，利用miRNA分析軟件(FindTar3)預(yù)測靶向H7N9各基因片段的可能miRNA，并在此基礎(chǔ)上篩選出靶點(diǎn)落在保守區(qū)的miRNA;最后，通過在線數(shù)據(jù)庫（microRNA.org）分析其在肺組織細(xì)胞A549中的表達(dá)豐

8、度，綜合評估表達(dá)豐度及靶點(diǎn)自由能，預(yù)測調(diào)控流感病毒H7N9基因片段的最佳人編碼miRNA。
　　結(jié)果：靶點(diǎn)分析得到種子區(qū)域匹配基因落在H7N9各基因片段保守區(qū)域的miRNA，分別是HA51條、NA37條、PB229條、PA19條和PB1-F226條;經(jīng)miRNA在肺組織細(xì)胞A549中的表達(dá)豐度分析，得到相對高表達(dá)、自由能小的miRNA，即可能調(diào)控流感病毒H7N9基因片段的最佳人編碼miRNA，分別是hsa-miR-16調(diào)控HA和P

9、B2片段、hsa-miR-21調(diào)控NA片段、hsa-miR-9調(diào)控PA片段和hsa-miR-193b調(diào)控PB1-F2片段。
　　結(jié)論：合理利用生物信息學(xué)在特定的組織細(xì)胞中預(yù)測靶向病毒基因片段的miRNA，可以為實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究及臨床治療提供較可靠的靶miRNA，但結(jié)果需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　第三章 HCV患者血清中miRNA異常表達(dá)譜的篩查及診斷潛能的評估
　　目的：利用miRNA芯片篩查HCV患者血清中miRNA

10、的異常表達(dá)譜，驗(yàn)證芯片結(jié)果并評價其診斷潛能，為進(jìn)一步研究HCV感染相關(guān)miRNA打下基礎(chǔ)。
　　方法：收集并挑選2013年1月～2013年9月期間珠江醫(yī)院未經(jīng)治療的HCV患者血清樣本，保存于-70℃。以miRNA PCR芯片篩查高豐度HCV-RNA(HCV-RNA≥105 IU/ml)血清樣本集合池中768個miRNA的表達(dá)，并在68例血清樣本中，包括HCV-RNA陽性（HCV-RNA≥5×102 IU/ml）39例和正常對照29

11、例，以miRNA PCR技術(shù)驗(yàn)證hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p的相對表達(dá)豐度，利用ROC曲線分析miRNA的診斷潛能。最后，通過miRNA預(yù)測軟件及文獻(xiàn)報道，對miRNA可能的作用靶點(diǎn)及功能進(jìn)行了初步分析。
　　結(jié)果：miRNA PCR芯片篩查HCV患者血清中miRNA的異常表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)符合條件的miRNA106條，其中包括表達(dá)上調(diào)51條和下調(diào)55條;單個

12、PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，在HCV感染血清中hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p的表達(dá)均上調(diào)(p＜0.01); ROC曲線分析顯示，hsa-miR-122具有較好的區(qū)分效能(AUC=0.950，95％ CI:0.905～0.994)，hsa-miR-629-5p的區(qū)分效能較差(AUC=0.704，95％CI:0.580～0.829)，而hsa-miR-134、hsa-miR

13、-424-3p具有中等的區(qū)分效能，相應(yīng)的AUC分別為:0.803(95％CI:0.698～0.909)、0.840(95％ CI:0.748～0.932)。此外，通過功能分析發(fā)現(xiàn)miRNA可在病毒的復(fù)制、炎癥免疫反應(yīng)和腫瘤形成等各個方面起著重要的調(diào)控作用。
　　結(jié)論：篩查HCV等傳染性疾病患者血清中miRNA的異常表達(dá)譜，對疾病的診斷，以及致病機(jī)理的研究具有重要意義。
　　小結(jié)
　　1.HA可誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生明顯的病理

14、反應(yīng)和促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)，這在H7N9感染宿主過程中可能起著重要作用。
　　2.HA可誘導(dǎo)Let-7e在THP-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐度上升而細(xì)胞外的豐度下降，在一定程度上解釋了H7N9患者血清中Let-7e表達(dá)下降的結(jié)果。
　　3.Let-7e可能作為炎癥抑制因子調(diào)控HA誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)激反應(yīng)，與H7N9的感染密切相關(guān)。
　　4.在特定的組織細(xì)胞中利用生物信息學(xué)預(yù)測靶向病毒基因片段的miRNA，可以為實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究及臨床治療提