HMGN2抗菌機(jī)制及其趨化活性的研究.pdf

1、本室首次報(bào)道核因子高遷移率組蛋白N2(High Mobility GroupChromosal protein N2，HMGN2)具有抗菌的新功能，本文旨在對HMGN2分子抗菌機(jī)制和是否具有趨化活性進(jìn)行研究，分為三個(gè)部分。 第一部分：組織源性和重組的HMGN2分離純化及鑒定。 [目的]制備組織細(xì)胞和重組質(zhì)粒來源的HMGN2分子。 [方法]用5％高氯酸萃取人或動(dòng)物組織或細(xì)胞，萃取物通過反相高效液相色譜進(jìn)一步分離純化

2、，收集目的分子。IPTG誘導(dǎo)HMGN2重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-c(+)-HMGN2，親合層析及高效色譜分離，收集相應(yīng)洗脫峰。用SDS-PAGE和Western blot方法鑒定分離純化的組織源性和重組的HMGN2分子；并用瓊脂糖凝膠彌散法對其抗菌活性鑒定。 [結(jié)果]SDS-PAGE顯示從組織細(xì)胞和重組表達(dá)質(zhì)粒中都制備得到了分子量約18KD的目標(biāo)分子，通過Western blot鑒定可見強(qiáng)陽性信號(hào)；而瓊脂糖凝膠彌散法顯示組織源

3、和重組HMGN2分子都具有抗大腸埃希菌作用，二者抗大腸埃希菌效能與人中性粒細(xì)胞防御素(HNP)相當(dāng)，對革蘭陽性菌無抗菌活性。 [結(jié)論]從組織細(xì)胞和重組質(zhì)粒制備了高純度并具抗大腸埃希菌活性的HMGN2分子，為后續(xù)研究其抗菌機(jī)制和生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。 第二部分：HMGN2分子抗大腸埃希菌機(jī)制研究。 [目的]探討HMGN2抗大腸埃希菌的機(jī)制。 [方法]采用細(xì)菌膜通透性實(shí)驗(yàn)，DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，用平板培養(yǎng)法制備

4、細(xì)菌早期和成熟生物被膜，銀染及電鏡觀察HMGN2對被膜形成干擾，及已形成生物被膜破壞。 [結(jié)果]HMGN2與大腸埃希菌共孵育，孵育上清OD<,280>、OD<,260>增大，與陰性組具有顯著性差異。同時(shí)HMGN2分子與大腸埃希菌K12質(zhì)粒DNA和染色體DNA呈濃度依賴性結(jié)合，阻滯了DNA在瓊脂糖膠中電泳遷移。銀染結(jié)果顯示：HMGN2與細(xì)菌共培養(yǎng)，濾膜透光性較強(qiáng)，未見黑染，而當(dāng)被膜形成后，用HMGN2分子處理，其早期和成熟被膜呈不

5、同程度的黑染消褪，透光性增強(qiáng)。HMGN2與細(xì)菌共培養(yǎng)，電鏡觀察顯示濾膜上不能形成生物被膜；細(xì)菌形成生物被膜后，HMGN2可使覆蓋于濾膜上的早期和成熟生物被膜破壞，僅見零星細(xì)菌附著。 [結(jié)論]HMGN2至少可通過兩種方式即影響細(xì)菌膜通透性和干擾細(xì)菌DNA轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮其抗大腸埃希菌的功能；生物被膜實(shí)驗(yàn)提示HMGN2分子可通過阻生物被膜形成及破壞已形成的生物被膜，影響大腸埃希菌的黏附定植和細(xì)菌的生長繁殖，增強(qiáng)對大腸埃希菌的清除能力。

6、 第三部分：探討HMGN2分子是否對中性粒細(xì)胞具有活化和趨化作用。 [目的]研究HMGN2分子是否可以活化中性粒細(xì)胞及是否具有趨化中性粒細(xì)胞的活性。 [方法]用密度梯度離心法和糖原誘導(dǎo)法分別從人外周血和豚鼠腹腔滲出液中分離中性粒細(xì)胞。用硝基四氮唑藍(lán)還原實(shí)驗(yàn)檢測HMGN2對中性粒細(xì)胞的活化效應(yīng)。采用Transwell趨化法和瓊脂糖膠下實(shí)驗(yàn)觀察HMGN2分子對中性粒細(xì)胞是否具有趨化效能。 [結(jié)果]還原實(shí)驗(yàn)顯示

7、HMGN2組陽性細(xì)胞為20％左右，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其與生理鹽水組無顯著差異，而LPS組活化細(xì)胞為65％左右，與生理鹽水組比較有顯著性差異；Transwell小池趨化，倒置相差顯微鏡觀察，HMGN2組遷移細(xì)胞平均數(shù)為47左右，與陰性對照組遷移細(xì)胞數(shù)相當(dāng)，無顯著差異，而干酪素陽性組遷移細(xì)胞平均數(shù)為200左右；瓊脂糖膠下實(shí)驗(yàn)光鏡觀察，LPS組遷移指數(shù)為3.64±0.53，陰性對照遷移指數(shù)分別為0.13±0.25，HMGN2組為0.17±0.23