HMGN2抗菌機制及其趨化活性的研究.pdf

1、本室首次報道核因子高遷移率組蛋白N2(High Mobility GroupChromosal protein N2，HMGN2)具有抗菌的新功能，本文旨在對HMGN2分子抗菌機制和是否具有趨化活性進行研究，分為三個部分。 第一部分：組織源性和重組的HMGN2分離純化及鑒定。 [目的]制備組織細胞和重組質(zhì)粒來源的HMGN2分子。 [方法]用5％高氯酸萃取人或動物組織或細胞，萃取物通過反相高效液相色譜進一步分離純化

2、，收集目的分子。IPTG誘導HMGN2重組表達質(zhì)粒pET-32a-c(+)-HMGN2，親合層析及高效色譜分離，收集相應洗脫峰。用SDS-PAGE和Western blot方法鑒定分離純化的組織源性和重組的HMGN2分子；并用瓊脂糖凝膠彌散法對其抗菌活性鑒定。 [結(jié)果]SDS-PAGE顯示從組織細胞和重組表達質(zhì)粒中都制備得到了分子量約18KD的目標分子，通過Western blot鑒定可見強陽性信號；而瓊脂糖凝膠彌散法顯示組織源

3、和重組HMGN2分子都具有抗大腸埃希菌作用，二者抗大腸埃希菌效能與人中性粒細胞防御素(HNP)相當，對革蘭陽性菌無抗菌活性。 [結(jié)論]從組織細胞和重組質(zhì)粒制備了高純度并具抗大腸埃希菌活性的HMGN2分子，為后續(xù)研究其抗菌機制和生物學功能打下了基礎(chǔ)。 第二部分：HMGN2分子抗大腸埃希菌機制研究。 [目的]探討HMGN2抗大腸埃希菌的機制。 [方法]采用細菌膜通透性實驗，DNA凝膠阻滯實驗，用平板培養(yǎng)法制備

4、細菌早期和成熟生物被膜，銀染及電鏡觀察HMGN2對被膜形成干擾，及已形成生物被膜破壞。 [結(jié)果]HMGN2與大腸埃希菌共孵育，孵育上清OD<,280>、OD<,260>增大，與陰性組具有顯著性差異。同時HMGN2分子與大腸埃希菌K12質(zhì)粒DNA和染色體DNA呈濃度依賴性結(jié)合，阻滯了DNA在瓊脂糖膠中電泳遷移。銀染結(jié)果顯示：HMGN2與細菌共培養(yǎng)，濾膜透光性較強，未見黑染，而當被膜形成后，用HMGN2分子處理，其早期和成熟被膜呈不

5、同程度的黑染消褪，透光性增強。HMGN2與細菌共培養(yǎng)，電鏡觀察顯示濾膜上不能形成生物被膜；細菌形成生物被膜后，HMGN2可使覆蓋于濾膜上的早期和成熟生物被膜破壞，僅見零星細菌附著。 [結(jié)論]HMGN2至少可通過兩種方式即影響細菌膜通透性和干擾細菌DNA轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮其抗大腸埃希菌的功能；生物被膜實驗提示HMGN2分子可通過阻生物被膜形成及破壞已形成的生物被膜，影響大腸埃希菌的黏附定植和細菌的生長繁殖，增強對大腸埃希菌的清除能力。

6、 第三部分：探討HMGN2分子是否對中性粒細胞具有活化和趨化作用。 [目的]研究HMGN2分子是否可以活化中性粒細胞及是否具有趨化中性粒細胞的活性。 [方法]用密度梯度離心法和糖原誘導法分別從人外周血和豚鼠腹腔滲出液中分離中性粒細胞。用硝基四氮唑藍還原實驗檢測HMGN2對中性粒細胞的活化效應。采用Transwell趨化法和瓊脂糖膠下實驗觀察HMGN2分子對中性粒細胞是否具有趨化效能。 [結(jié)果]還原實驗顯示

7、HMGN2組陽性細胞為20％左右，統(tǒng)計學分析顯示其與生理鹽水組無顯著差異，而LPS組活化細胞為65％左右，與生理鹽水組比較有顯著性差異；Transwell小池趨化，倒置相差顯微鏡觀察，HMGN2組遷移細胞平均數(shù)為47左右，與陰性對照組遷移細胞數(shù)相當，無顯著差異，而干酪素陽性組遷移細胞平均數(shù)為200左右；瓊脂糖膠下實驗光鏡觀察，LPS組遷移指數(shù)為3.64±0.53，陰性對照遷移指數(shù)分別為0.13±0.25，HMGN2組為0.17±0.23