大環(huán)內(nèi)酯衍生物抗菌活性篩選及抗菌機(jī)制初步研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥呈逐年上升趨勢(shì)，給感染性疾病的治療帶來(lái)極大的困難。因此，日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問(wèn)題促進(jìn)了抗耐藥菌活性化合物的篩選及機(jī)制研究工作。本研究篩選了一批大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的抗耐藥菌活性，得到三個(gè)活性較好的化合物，對(duì)其藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步對(duì)其抗菌作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　 一、大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的抗菌活性篩選
　　 以最低抑菌濃度(MIC，minimalinhibit

2、oryconcentration)作為指標(biāo)評(píng)價(jià)待測(cè)化合物的抗菌活性，MIC的測(cè)定以微量稀釋法采用大環(huán)內(nèi)酯耐藥的肺炎鏈球菌株，篩選了C、F、J、K、L、M、N、O八個(gè)系列共105個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物。得到了三個(gè)具有較好抗菌活性的化合物，分別為C6、C7、F7。三者對(duì)肺炎鏈球菌耐藥株的MIC值在0.06～2μg/ml之間，抗菌效果明顯優(yōu)于對(duì)照藥組（紅霉素，克拉霉素及阿奇霉素對(duì)照）。
　　 二、體外抗菌作用研究
　　 該部分對(duì)前

3、期篩選出的化合物C6、C7、F7進(jìn)行進(jìn)一步的藥效學(xué)研究。采用臨床新近分離的8株肺炎鏈球菌耐藥株對(duì)其進(jìn)行抗菌活性篩選，進(jìn)行了MIC及MBC的測(cè)定，并對(duì)這8株細(xì)菌的耐藥基因ermB，ermA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，確定了其主要耐藥機(jī)制。觀察了pH值、細(xì)菌接種量對(duì)待測(cè)化合物抗菌活性的影響，并繪制了化合物F7的殺菌曲線。
　　 1.C6、C7、F7對(duì)臨床分離株的抗菌活性
　　 臨床分離耐藥株中有6株為甲基化耐藥株，2株為混合耐藥株。所篩

4、選出的三個(gè)化合物對(duì)臨床分離株也具有很好的抗菌效果，MIC值均小于2μg/ml，在高濃度下顯示殺菌效果，MBC約為MIC值的4～32倍。
　　 2.培養(yǎng)條件對(duì)C6、C7、F7抗菌活性的影響
　　 細(xì)菌接種量由103增加至107CFU/ml時(shí)，MIC值約升高4～64倍，培養(yǎng)基的pH值由5增加到9時(shí)，MIC值隨之降低約32～258倍。表明細(xì)菌接種量、pH值均對(duì)MIC有影響。當(dāng)pH值為9時(shí)，MIC值最小，說(shuō)明所測(cè)化合物在堿性條件

5、下具有更強(qiáng)的抗菌效果。
　　 3.殺菌曲線
　　 在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入不同濃度的待測(cè)藥物，在不同時(shí)間點(diǎn)取一定量的培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，繪制出化合物F7的殺菌曲線。結(jié)果表明，F(xiàn)7對(duì)金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌只顯現(xiàn)出抑菌作用。而在4×MIC時(shí)，對(duì)肺炎鏈球菌顯示出殺菌作用。
　　 三、體內(nèi)抗菌活性研究
　　 選擇F7，對(duì)其體內(nèi)抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。肺炎鏈球菌經(jīng)提毒后確定100％最小致死量。將小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為F7

6、高、中、低劑量組，紅霉素對(duì)照組及空白對(duì)照組。用所確定的最小致死量腹腔注射感染小鼠，感染后立即靜脈注射受試藥物，并在給藥6小時(shí)后再次給藥。給藥后觀察5～7天，記錄各組小鼠存活數(shù)，并確定ED50，結(jié)果顯示ED50值為24.83mg/kg。
　　 四、F7細(xì)胞毒性檢測(cè)
　　 通過(guò)MTT法檢測(cè)F7對(duì)人體正常肝細(xì)胞活性影響。結(jié)果顯示，隨著化合物濃度的增加，細(xì)胞毒性逐漸增大，TC50值為17.04μg/ml。
　　 五、抗菌

7、機(jī)制初步研究
　　 1.F7對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響
　　 通過(guò)電鏡觀察了F7對(duì)肺炎鏈球菌外部形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)F7作用后，細(xì)菌的外部形態(tài)嚴(yán)重扭曲變形呈不規(guī)則形，部分細(xì)菌嚴(yán)重皺縮，表面出現(xiàn)隆起或凹陷;細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜出現(xiàn)部分缺損，細(xì)胞內(nèi)核電子密度大大降低，甚至出現(xiàn)大塊、不均一的透電子區(qū)。
　　 2.F7對(duì)肺炎鏈球菌耐藥基因mefA及ermB表達(dá)的影響
　　 采用RT-PCR法檢測(cè)F7對(duì)肺炎鏈球

8、菌外排泵耐藥基因mefA及甲基化耐藥基因ermB表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)所用菌株為肺炎鏈球菌混合耐藥株(A+B14)，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，藥后4h、8h、12h組。結(jié)果顯示:給藥組的耐藥基因mefA及ermB的表達(dá)量有所降低，且其降低趨勢(shì)呈一定的時(shí)間依賴性。表明F7能夠明顯抑制肺炎鏈球菌耐藥基因mRNA水平的表達(dá)。
　　 3.F7對(duì)細(xì)菌體內(nèi)DNA及蛋白含量的影響
　　 采用DAPI染色法檢測(cè)藥物作用后細(xì)菌體內(nèi)DNA含量的變化，結(jié)