過量表達GAD系統(tǒng)關鍵基因提升乳酸乳球菌γ-氨基丁酸生產性能.pdf

1、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡稱GABA）是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，具有降低血壓、鎮(zhèn)定安神、預防癲癇、調節(jié)激素分泌、改善睡眠、抗抑郁和保肝利腎等多種生理功能，因此受到廣泛關注。在制備GABA的多種方法中，生物催化合成法因反應周期短、環(huán)境友好而備受矚目。大腸桿菌Escherchiacoli以其生長迅速、產量高等優(yōu)點一度成為制備GABA的熱門菌種，然而E.coli因存在安全隱患而無法應用于食品工業(yè)。因此，尋求

2、更加安全、高效的GABA生產菌株顯得尤為重要。
　　本文以工業(yè)化細胞工廠中的模式菌株Lactococcus lactis NZ9000為宿主細胞，通過代謝工程和微生物生理生化分析等技術手段考察了過表達Lc.lactis subsp.lactis CV56谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)抗酸系統(tǒng)中的關鍵基因對其GABA合成性能的影響，同時探究了影響重組工程菌株催化活性的主要因素，并于最優(yōu)反應條件

3、下考察游離乳酸菌細胞催化性能。
　　首先，Lc.lactis subsp.lactis CV56基因序列分析顯示gadB基因全長1401bp，編碼466個氨基酸，理論推算的分子量約為53.8 kDa。與其它功能已知的GAD相類似，GADCV56含有高度保守的賴氨酸殘基(K277)、蘇氨酸殘基(T213)和天冬氨酸殘基(D245)，以及一段高度保守的{H(I/V)DAASGG}基序。通過構建重組載體pET28a-gadB及重組菌株E

4、.coli BL21(DE3):pET28a-gadB，實現(xiàn)了GAD CV56在大腸桿菌中過量表達。所獲取的重組GADCV56具有催化L-谷氨酸(L-Glu)生成GABA的能力，其最適pH為4.7，最適反應溫度為50℃;且重組GAD熱穩(wěn)定性較高，在60℃條下保溫2h后仍能保持40％以上的酶活。動力學常數(shù)測定顯示其Km值為3.88 mM，Vmax為58.66U/mg。
　　采用PCR擴增技術獲取編碼GAD和Glu-GABA反轉運蛋白

5、的基因片段，分別構建至Lc.lactis NZ9000中，獲取重組工程菌株Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadB和Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB。在搖瓶發(fā)酵條件下，兩菌株與對照菌株Lc.lactis NZ9000的生長相似，外源基因的導入沒有導致重組工程菌株生物量的明顯下降。GAD在Lc.lactis NZ900中過量表達時，經誘導45h后，發(fā)酵液中GABA的含量是對照組的7.02倍;而

6、在此基礎上進一步過量表達Glu-GABA反轉運蛋白時，菌體細胞中反應底物和產物的跨膜輸送過程得到強化，從而表現(xiàn)出更高的催化活性，GABA產量是對照組的16.63倍。同時，將gadB-CV56基因片段克隆入pNZ8149中，并構建相應的表達系統(tǒng)，獲得可直接應用于食品行業(yè)的食品級重組工程菌株Lc.lactis NZ3900:pNZ8149-gadB。
　　以Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB為對象，考察靜息態(tài)

7、細胞催化時菌齡、緩沖體系、反應液pH值、溫度、5'-磷酸吡哆醛(PLP)對其合成GABA能力的影響。研究結果顯示其最適反應條件為:菌體誘導時間4h，以pH4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液為反應體系，反應溫度45℃。在最適反應條件下進行游離細胞轉化實驗，細胞體外催化60h后，Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadB和Lc.lactisNZ9000:pNZ8148-gadCB催化合成GABA產量分別為37.71g/L和43.32