產(chǎn)γ--氨基丁酸乳酸菌選育及其發(fā)酵鷹嘴豆乳對神經(jīng)細胞損傷的保護作用.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、抗焦慮、延緩腦衰老，營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化等多種生理功能，生產(chǎn)富含GABA的功能性食品，能更好地發(fā)揮其保健功效。乳酸菌是公認安全的一類益生菌，廣泛用于食品發(fā)酵，且其具有將谷氨酸或谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化成GABA的能力，因此，可采用乳酸菌發(fā)酵的方式來增加食品中的GABA含量，增強食品的營養(yǎng)和功能特性。鷹嘴豆營養(yǎng)豐富，具有較好的食用和藥用價值，可作為乳酸菌生長并富集GA

2、BA的良好食品基質(zhì)。在對其功能的研究上，選用神經(jīng)細胞的模式細胞株P(guān)C12細胞，利用MnCl2對細胞造成損傷，考察富含GABA的發(fā)酵鷹嘴豆乳提取物對損傷細胞的保護作用及機制，將有助于更好地理解鷹嘴豆乳中功能性因子GABA的作用，同時為富含GABA鷹嘴豆乳保健功效的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　本研究旨在對具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌進行篩選，通過誘變和利用響應(yīng)面優(yōu)化法提高菌株在鷹嘴豆乳中的GABA產(chǎn)量，從而獲得富含GABA鷹嘴豆乳的生

3、產(chǎn)工藝，進一步采用MnCl2損傷的PC12細胞模型探討富含GABA的鷹嘴豆乳提取物對神經(jīng)細胞的保護作用及機制，主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過紙層析初篩、液相復篩，從分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品的377株乳酸菌中篩選到17株能產(chǎn)GABA的菌株，其中M-6產(chǎn)量最高，發(fā)酵48h后，其在含1％谷氨酸鈉(MSG)的MRSG培養(yǎng)基和含0.2％ MSG的鷹嘴豆乳中的GABA產(chǎn)量分別為584.26 mg/L和282.12 mg/L。經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化

4、試驗及16S rDNA基因鑒定，確定M-6為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。植物乳桿菌M-6含調(diào)控GABA合成的谷氨酸脫羧酶(GAD)基因，該基因全長1410 bp，編碼含469個氨基酸的蛋白，預測分子量53.7kDa，等電點pI為5.58，其與植物乳桿菌GB01-21、Taj-Apis362、德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842、短乳桿菌OPK-3、乳酸乳球菌的GAD氨基酸序列分別顯示99％，99％，

5、94％，94％，68％的相似性。
　　2.以植物乳桿菌M-6作為出發(fā)菌株，分別進行紫外、紫外-氯化鋰復合誘變，確定紫外照射最佳時間為240 s，氯化鋰最佳濃度為0.15％，此時致死率為80％左右，有利于正突變的發(fā)生。經(jīng)誘變后，菌株的形態(tài)未發(fā)生明顯改變。采用MSG平板法、紙層析法、berthelot比色法和高效液相色譜(HPLC)法對突變株的產(chǎn)GABA特性進行監(jiān)測，篩選到21株GABA產(chǎn)量高于出發(fā)菌株的突變株，其中紫外-氯化鋰誘變所

6、得突變株M'-6產(chǎn)量最高，其在MRSG培養(yǎng)基(含1％ MSG)和鷹嘴豆乳(含0.2％ MSG)里的產(chǎn)量分別為899.27 mg/L和369.53mg/L，比出發(fā)菌株分別提高64.25％和30.46％，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　3.通過單因素試驗和響應(yīng)面分析得出植物乳桿菌發(fā)酵的鷹嘴豆乳產(chǎn)GABA的最優(yōu)條件為:底物MSG0.2％、磷酸吡哆醛(PLP)55μM、pH自然、接種量7％、發(fā)酵溫度39℃，經(jīng)48 h發(fā)酵，GABA可達537.

7、23 mg/L，完全可以滿足人體每天對GABA的需求量為30-100 mg的要求。鷹嘴豆乳在發(fā)酵產(chǎn)GABA的過程中，可溶性蛋白含量下降，說明菌體可利用可溶性蛋白;蛋白電泳結(jié)果顯示鷹嘴豆蛋白的7Sα'亞基和11S堿性亞基更容易被植物乳桿菌利用;反相高效液相色譜(RP-HPLC)結(jié)果顯示發(fā)酵過程中有一些小肽的生成，也有一些小肽被菌體的肽酶利用;發(fā)酵過程中，游離氨基酸態(tài)氮(FAN)含量上升，且FAN濃度與GABA濃度呈顯著正相關(guān)(r2=0.7

8、62，P＜0.01);游離氨基酸檢測結(jié)果顯示:幾乎所有氨基酸含量都有所上升，必需氨基酸含量上升。蛋白降解過程可為GABA的生成提供底物，從而促進GABA的產(chǎn)生，同時有助于增強鷹嘴豆乳的營養(yǎng)與功能特性。
　　4.經(jīng)MTT法測定，富含GABA的發(fā)酵鷹嘴豆乳提取物(FCE)在500-2000μg/mL的濃度范圍內(nèi)對PC12細胞無毒性，建立750μM MnCl2損傷的PC12細胞模型，F(xiàn)CE能夠顯著地提高細胞的存活率，且隨濃度增大，保護作

9、用增強。倒置相差顯微鏡結(jié)果顯示FCE能夠使損傷細胞的形態(tài)恢復正常，保持細胞的完整性和良好的貼壁性;熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示FCE能夠使得損傷細胞的比例減少，正常細胞的比例增多;FCE能夠保持細胞膜的完整性，從而降低損傷細胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(LDH)酶活;FCE能夠提高MnCl2誘導的損傷細胞中的抗氧化酶:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)酶活及抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的含量，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);流式細胞儀分析表明FCE能