生理工程策略提升乳酸菌γ-氨基丁酸合成效率的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)作為一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有多種重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。通過(guò)益生性乳酸菌催化生產(chǎn)GABA已是人們目前普遍共識(shí)。然而，理解乳酸菌中GABA合成途徑及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制是強(qiáng)化乳酸菌作為細(xì)胞工廠高效生產(chǎn)該物質(zhì)的前提。本文以課題組從鮮牛奶中分離得到的一株GABA高產(chǎn)菌株短乳桿菌(Lactobacillus brevis CGMCC1306

2、)為出發(fā)菌株，在解析其谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)(GAD system)表達(dá)調(diào)控機(jī)制及關(guān)鍵蛋白催化特性，分析菌株GAD系統(tǒng)、F1Fo-ATPase質(zhì)子泵、胞內(nèi)微環(huán)境及耐受酸脅迫之間關(guān)系的基礎(chǔ)上，采用生理工程策略通過(guò)代謝工程與合成生物學(xué)手段強(qiáng)化乳酸菌GAD代謝途徑、調(diào)控胞內(nèi)微環(huán)境及細(xì)胞膜通透性，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)工程菌株及混合發(fā)酵體系的構(gòu)建與GABA的高效合成。主要結(jié)果如下:
　　(1)建立了短乳桿菌遺傳操作方法，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quanti

3、tativereal-time PCR)和基于溫敏性pGhost4系統(tǒng)的染色體無(wú)痕敲除技術(shù)等手段解析了Lb.brevis CGMCC1306染色體上gad operon的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制，并探討了GAD系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞抵御酸脅迫及GABA合成過(guò)程中的作用。研究表明:Lb.brevis CGMCC1306含有兩個(gè)谷氨酸脫羧酶基因，其中g(shù)adB與其上游的gadR及gadC連鎖并以基因簇gadRCB形式存在于染色體上;gadA遠(yuǎn)離該基因簇

4、單獨(dú)出現(xiàn)在染色體上;gadC與gadB形成gadCB operon，共同轉(zhuǎn)錄和表達(dá);gadR單獨(dú)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并陽(yáng)性調(diào)控gadCB operon的轉(zhuǎn)錄，為促進(jìn)因子。gadCB operon所編碼的蛋白是該菌株GAD活性的主要提供者，對(duì)細(xì)胞抵御酸脅迫起到了重要的作用。
　　(2)建立了基于比色法的高GAD活性菌株高通量篩選方法，并成功獲取了兩株F1Fo-ATPase活性弱化但GAD活性增強(qiáng)的Lb.brevis突變菌株。分析了F1Fo-A

5、TPase活性弱化菌株與對(duì)照菌株胞內(nèi)微環(huán)境的差異，為理解GAD活性增強(qiáng)的原因和采用生理工程策略改造菌株提升GABA合成效率提供了理論支撐。結(jié)果顯示:Lb.brevis的GABA合成過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)外pH、細(xì)胞膜FoF1-ATPase活性及菌株GAD系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白催化性能之間存在著緊密關(guān)系。在適宜的酸脅迫條件下過(guò)量表達(dá)GAD系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白并適當(dāng)弱化F1Fo-ATPase活性，能夠有效促進(jìn)Lb.brevis生產(chǎn)GABA的性能。其中，基于上述理論所獲

6、取的重組菌株Lb. brevis/pMG36e-gadA的F1Fo-ATPase缺陷突變株Lb.brevis NRA6具有相對(duì)較高的GAD活性?？厮?pH5.2)厭氧批次發(fā)酵條件下，該工程菌株在48 h內(nèi)可累積GABA至43.65 g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.42％;為野生菌株的1.22倍。
　　(3)通過(guò)篩選并理性改造來(lái)源于植物乳桿菌的谷氨酸脫羧酶(LpGadB)，獲得了C-末端截短的但具有相對(duì)更寬泛催化pH范圍的LpGadB突變體

7、LpGadB△C11。在此基礎(chǔ)上，基于生理工程策略合理組合GAD系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白及突變體并強(qiáng)化其表達(dá)，有效促進(jìn)了Lb.brevis的GABA合成效率。其中，重組菌株Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC在分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，72 h可有效產(chǎn)生GABA高達(dá)104.38 g/L，為野生菌株的1.28倍。與此同時(shí)，采用上述策略并以乳酸菌模式菌株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis NZ9000）為出發(fā)菌株，進(jìn)一步構(gòu)建了

8、目標(biāo)菌株Lc.lactis NZ9000/pNZ8148-LpgadB△11-LcgadC，并考察了其GABA合成性能。自然發(fā)酵條件下，在含有60 g/L MSG的GM17發(fā)酵培養(yǎng)基中，36h時(shí)該重組菌株GABA產(chǎn)量達(dá)18.94 g/L;而采用兩階段pH調(diào)控策略進(jìn)一步有效增強(qiáng)了菌株GABA合成效率，發(fā)酵36 h時(shí)，GABA產(chǎn)量積累至30.89 g/L，為自然發(fā)酵條件下產(chǎn)量的1.63倍;而48 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，GABA產(chǎn)量高達(dá)32.16 g

9、/L，轉(zhuǎn)化率為87.92％，為目前基于乳酸乳球菌細(xì)胞批次發(fā)酵生產(chǎn)GABA所報(bào)道的最高水平。
　　(4)通過(guò)合成生物學(xué)手段建立了基于溫和型乳球菌噬菌體(lactococcalbacteriophage rlt)裂解盒（LytHA）與糞腸球菌（Ec.faecalis LMG2333）細(xì)菌素(EnlA)的乳酸菌混合發(fā)酵體系中可控裂解平臺(tái)工程菌株。實(shí)現(xiàn)了共培養(yǎng)體系中Lc.lactis細(xì)胞的可控裂解及Lb.brevis細(xì)胞膜的透性化，有效削

10、弱了GABA合成過(guò)程中Glu/GABA跨膜運(yùn)輸阻力，進(jìn)一步提升了重組Lc.lactis及Lb.brevis細(xì)胞合成GABA的效率。在Lc.lactics NZ9000/pNZ8148-LcgadB與pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB的混合催化體系中，36h時(shí)GABA濃度達(dá)37.64 g/L;而在pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB與Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC的混合發(fā)酵體系中，48