2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種在自然界廣泛分布的非蛋白質(zhì)氨基酸,具有很多重要的功能和作用,可以被應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。其主要制備方法主要有微生物發(fā)酵法、植物富集法和化學(xué)合成法三種。本論文主要利用野生型大腸桿菌E.coil K12作為出發(fā)菌株,通過(guò)基因工程手段改造GABA的代謝途徑,以提高工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量。主要研究如下:
  1.利用Red同源重組技術(shù)來(lái)敲除與大腸桿菌K

2、12中GABA分解途徑相關(guān)的三個(gè)基因gabT、gabP、puuE。構(gòu)建同源臂75bp左右的打靶線性片段,在質(zhì)粒pKD46表達(dá)Exo、Beta和Gam3種酶的作用下,敲除gabT基因,再導(dǎo)入質(zhì)粒pCP20,pCP20可以編碼能夠識(shí)別FLP位點(diǎn)特異性重組酶,消除目的基因位置上的抗性基因,再利用目的基因位置兩側(cè)的鑒定引物進(jìn)行PCR,得到的產(chǎn)物片段的鑒定gabT基因敲除成功。得到基因敲除菌株E.coli K12△gabT,隨后以E.coliK1

3、2△gabT作為出發(fā)菌株,成功敲除其gabP基因,得到基因敲除菌株E.coliK12△gab T△gabP,最后以E.coli K12△gabT△gabP作為出發(fā)菌株,成功敲除其puuE基因,得到基因敲除菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE。
  2.將與GABA合成途徑相關(guān)的三個(gè)基因gadA、gadB、gadC構(gòu)建到質(zhì)粒ptrc99A上,利用雙酶切和測(cè)序?qū)ζ桨迳仙L(zhǎng)出來(lái)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定,得到重組質(zhì)粒ptrc99

4、A-gadABC,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入基因敲除菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE,得到工程菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE/ptrc99A-gadABC。在搖瓶水平上,進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)GABA。與原始菌株GABA的產(chǎn)量0.11g/L相比,工程菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE發(fā)酵產(chǎn)GABA的產(chǎn)量提升到0.73g/L,證明了敲除三種基因提升GABA產(chǎn)量的可行性。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入基因敲除菌株

5、中,菌株E.coliK12△gabT△gabP△puuE/ptrc99A-gadABC發(fā)酵產(chǎn)GABA,其產(chǎn)量為6.4g/L,與基因敲除菌株相比,GABA產(chǎn)量大大提高,進(jìn)一步證明基因工程手段改造GABA代謝途徑的成功。
  3.對(duì)工程菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE/ptrc99A-gadABC的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先展開(kāi)單因素實(shí)驗(yàn),確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成成分和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件,隨后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行P

6、B試驗(yàn),選出發(fā)酵培養(yǎng)基中影響GABA產(chǎn)量的關(guān)鍵因子,分別為底物濃度,葡萄糖濃度和胰蛋白胨濃度。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),得到當(dāng)三個(gè)關(guān)鍵因子達(dá)到最佳值,分別為谷氨酸鈉濃度34.59g/L,葡萄糖濃度8.97g/L,胰蛋白胨濃度24.47g/L時(shí),GABA產(chǎn)量達(dá)到最大值為19.38g/L。得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖8.97g/L,酵母粉16g/L,胰蛋白胨24.47g/L,L-谷氨酸34.59g/L,硫酸銨5g/L,磷酸鹽40mM

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