大腸桿菌好氧發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的代謝工程研究.pdf

1、蘋果酸，又名2－羥基丁二酸，是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)的重要一員，其酸味持久柔和，是優(yōu)良的酸味劑，蘋果酸在醫(yī)藥、食品等多個行業(yè)中都有廣泛用途。蘋果酸的生產(chǎn)方法包括從植物中提取，酶轉(zhuǎn)化法，化學合成法及微生物發(fā)酵法，由于能源和環(huán)境的日益惡化，微生物發(fā)酵法越來越受重視。本文通過代謝工程的策略構(gòu)建了能夠利用甘油、葡萄糖為底物高效生產(chǎn)蘋果酸的大腸桿菌菌株。
　　本文對大腸桿菌利用甘油、葡萄糖為底物生產(chǎn)蘋果酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型進行了系統(tǒng)分析，通過截斷蘋

2、果酸消耗途徑，增強羧化通量，阻斷副產(chǎn)物積累途徑等策略構(gòu)建了一系列生產(chǎn)蘋果酸的菌株；并在好氧條件下分別以甘油和葡萄糖為碳源進行發(fā)酵，考察菌株生產(chǎn)蘋果酸的能力。發(fā)酵結(jié)果顯示，不同碳源對蘋果酸的積累有影響。
　　首先在大腸桿菌E2中過表達了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，得到菌株E21，以甘油為底物蘋果酸積累量從0.76提高到4.69 g/L，說明乙醛酸途徑的增強有利于蘋果酸的積累。采用單敲除和組合敲除策略，敲除蘋果酸脫氫酶基因mdh

3、，mqo及蘋果酸酶基因maeA和maeB。其中表現(xiàn)優(yōu)異的菌株E23（E21，△maeA，△maeB）利用9.8 g/L甘油積累了5.14 g/L蘋果酸，蘋果酸得率為0.36 mol/mol甘油。說明阻斷蘋果酸的消耗途徑對于蘋果酸的積累是有利的。
　　通過引入谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的丙酮酸羧化酶基因pyc和產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）的pc

4、k基因，增強菌株的羧化途徑，但是在以甘油為底物進行好氧發(fā)酵時，羧化途徑的增強并沒有進一步提高蘋果酸的產(chǎn)量。
　　以葡萄糖為底物進行好氧發(fā)酵，表現(xiàn)突出的菌株為雙敲除菌株E23（E21，△maeA，△maeB）和E21（pTrcpyc），蘋果酸得率分別為0.62 mol/mol和0.79 mol/mol葡萄糖。說明解除蘋果酸的消耗途徑對于蘋果酸的積累是有利的，同時由于丙酮酸的濃度由于葡萄糖通過PTS系統(tǒng)運輸而保持較高的水平，pyc基因