聚蘋果酸生產(chǎn)菌的高通量篩選及發(fā)酵特性研究.pdf

1、聚蘋果酸（Polymalic acid, PMA）是由類酵母真菌出芽短梗霉（A.pullulans）發(fā)酵生產(chǎn)的以 L-蘋果酸為唯一單體的聚酯型聚合物，具有良好的水溶性、生物可降解性、易修飾性和無(wú)免疫原性的特點(diǎn)，在生物可降解材料、藥物載體、組織修復(fù)等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。聚蘋果酸的合成主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法兩種。化學(xué)合成聚蘋果酸有著分子量低、反應(yīng)條件苛刻和分離純化較難的問(wèn)題；而微生物發(fā)酵法合成的聚蘋果酸有產(chǎn)物較純，分子量大，環(huán)境無(wú)污

2、染的優(yōu)點(diǎn)。因此，通過(guò)生物發(fā)酵法獲得聚蘋果酸更具優(yōu)勢(shì)。本文針對(duì)目前發(fā)酵法生產(chǎn)聚蘋果酸的糖酸轉(zhuǎn)化率低等方面的不足，以本實(shí)驗(yàn)室保藏的出芽短梗霉（A. pullulans CCTCC M2012223）為出發(fā)菌株，開(kāi)展菌株的高通量篩選和發(fā)酵特性的研究，
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴一個(gè)新的羅丹明類熒光探針R被合成和表征。L-蘋果酸緩沖液考察探針R和溶液pH值之間的光學(xué)響應(yīng)，結(jié)果表明，當(dāng)pH值在2.4-4.4范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度和pH值有良好的線

3、性關(guān)系：Y=﹣1555.6X+6837.2，R2=0.9744。ARTP構(gòu)建突變庫(kù)，以探針R的熒光強(qiáng)度為篩選條件，約1000個(gè)突變株被用于高通量篩選；其中，突變株AH-21的熒光強(qiáng)度明顯比其他突變株要高，為181.14±17.82，比出發(fā)菌株提高了28.57％。搖瓶復(fù)篩，確認(rèn)菌株的高單位和遺傳穩(wěn)定性。3L發(fā)酵罐批發(fā)酵結(jié)果表明，AH-21細(xì)胞生長(zhǎng)速率更快，而葡萄糖消耗速率無(wú)明顯差異；PMA的產(chǎn)量在76h達(dá)到41.9g/L，在相同培養(yǎng)條件下

4、比原始菌株的產(chǎn)量提高了13.8%。補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行，經(jīng)過(guò)三次補(bǔ)加碳源和少量氮源，發(fā)酵180h后PMA的產(chǎn)量高達(dá)127.2g/L，產(chǎn)酸速率為0.71g/L h。糖酸轉(zhuǎn)化率為0.51g/g葡萄糖。⑵應(yīng)用活細(xì)胞傳感儀檢測(cè)出芽短梗霉種子在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況。種子培養(yǎng)36h，隨著 NH4NO3濃度的增加，活細(xì)胞數(shù)量（電容值）由較低的2.3pF/cm增加到11.9pF/cm，增長(zhǎng)顯著。種子培養(yǎng)到72h時(shí)，4g/L NH4NO3

5、組有著最快的細(xì)胞增長(zhǎng)速率，從最初的8.0pF/cm增加到11.9 pF/cm。發(fā)酵結(jié)果顯示，中等氮條件下（4 g/L NH4NO3）PMA的產(chǎn)量最高（32.1 g/L）；和低氮條件（2g/L NH4NO3）相比，產(chǎn)量提高了14.2%。因此，確定種子培養(yǎng)72h、NH4NO3濃度4g/L，為最佳種子培養(yǎng)條件。進(jìn)一步的在5L發(fā)酵罐上考察種子培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，結(jié)果表明優(yōu)化組（4 g/L NH4NO3）和對(duì)照組（2 g/L NH4NO3）相比

6、，聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量比對(duì)照組高了8.9%；電導(dǎo)率增加值比對(duì)照組的增加值提高了10.2%。⑶活細(xì)胞在線傳感儀對(duì)發(fā)酵過(guò)程分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞半徑成反比的fc值在細(xì)胞生長(zhǎng)階段快速下降，預(yù)示著細(xì)胞半徑在逐漸增大；表明發(fā)酵過(guò)程出芽短梗霉細(xì)胞存在細(xì)胞膨大現(xiàn)象，與顯微鏡觀察結(jié)果一致。同時(shí)在產(chǎn)酸階段（25-66h），對(duì) PMA產(chǎn)量和發(fā)酵液電導(dǎo)率進(jìn)行線性擬合；分析發(fā)現(xiàn)，PMA的含量和電導(dǎo)率的變化有良好的線性關(guān)系，y=0.0649x+3.5799，R2=0.98