微生物高效生產(chǎn)吡咯喹啉醌和聚蘋果酸的研究.pdf

1、吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)和β-聚蘋果酸[poly(β-L-malic acid)，PMLA]是兩種具有多種不同用途的生物化學(xué)品，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。本文從多個(gè)角度較系統(tǒng)地開展了這二種重要生物化學(xué)品的高效合成機(jī)制研究及新工藝開發(fā)。
　　論文首先對(duì)三種PQQ測(cè)定方法進(jìn)行比較研究，明確了不同PQQ檢測(cè)方法的特點(diǎn)和適用范圍。利用GDH酶法檢測(cè)高靈敏度特點(diǎn)，制備高效篩選PQQ產(chǎn)

2、生菌的活性檢測(cè)試紙，建立了從土壤中篩選PQQ高產(chǎn)菌的高通量篩選方法。在此基礎(chǔ)上，篩選到了一株能以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)的PQQ高產(chǎn)菌(Methylobacillussp.zju323)，并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號(hào)為M2016079，搖瓶培養(yǎng)結(jié)果表明PQQ產(chǎn)量達(dá)到25.8 mg/L。
　　然后利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化研究。結(jié)合響應(yīng)面、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析以及遺傳算法優(yōu)化，得到關(guān)鍵培養(yǎng)基組分

3、和最佳濃度:CoC12·6H2O、PABA和MgSO4·7H2O，優(yōu)化后濃度分別為3.2 mg/L、418.7μg/L和1.5 g/I。建立了pH雙階段控制發(fā)酵策略，即發(fā)酵48 h前控制pH為6.8，之后pH為5.8，在補(bǔ)料發(fā)酵中前期補(bǔ)加甲醇，后期補(bǔ)加酵母粉。最后利用等離子體(ARTP)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變以及兩者復(fù)合誘變育種后，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝補(bǔ)料發(fā)酵，PQQ濃度接近450.0 mg/L。
　　利用本實(shí)驗(yàn)室早

4、期篩選的聚蘋果酸生產(chǎn)菌Aurobasidium pullulans ZD-3d(CGMCC4605)，開展了高產(chǎn)聚蘋果酸新策略的研究。首先比較了葡萄糖與木薯淀粉水解液對(duì)PMLA合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生木薯淀粉水解液更有利于PMLA合成。同時(shí)研究了膜微濾和離心分離回收細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵技術(shù)，當(dāng)離心分離回收細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵時(shí)細(xì)胞活力提高，循環(huán)發(fā)酵次數(shù)增加至5次，聚蘋果酸濃度為76.2～39.6 g/L，產(chǎn)率0.98～1.76 g L-1 h-1，得率0

5、.78～0.86 g/g，均高于膜微濾回收細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了鈣離子對(duì)聚蘋果酸合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣離子組中有458種差異蛋白，對(duì)照組中含有726種差異蛋白。對(duì)差異蛋白GO富集分析發(fā)現(xiàn)鈣離子組中有104種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這有利于蘋果酸和聚蘋果酸的胞內(nèi)運(yùn)輸和胞外分泌。
　　本論文一方面建立了高通量篩選高產(chǎn)PQQ菌的方法、優(yōu)化了培養(yǎng)條件與發(fā)酵工藝、利用誘變育種技術(shù)提高了PQQ產(chǎn)量，另一方面，發(fā)展了回收細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵合成聚蘋