雞內(nèi)服酒石酸泰樂菌素首過效應及其機制的研究.pdf

1、酒石酸泰樂菌素是一種廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗菌藥，具有抗菌活性高、不良反應小、口服后吸收迅速、分布廣泛、生物利用度低的特點。然而，國內(nèi)外未見其口服后生物利用度很低的機理報道。為此，本試驗擬開展肉雞口服酒石酸泰樂菌素的首過效應及機制研究，通過肝腸首過效應的定量研究、雞肝細胞內(nèi)的代謝消除和腸細胞內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運以及酒石酸泰樂菌素在持續(xù)用藥過程對代謝、轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白表達的影響，深入探討酒石酸泰樂菌素首過效應的機制，最后針對其原因探討

2、提高其口服生物利用度的策略。具體內(nèi)容如下:
　　1.酒石酸泰樂菌素在肉雞體內(nèi)生物利用度測定
　　本研究旨在測定酒石酸泰樂菌素的口服生物利用度。首先建立泰樂菌素高效液相(HPLC)分析方法，然后測定酒石酸泰樂菌素藥動學特點。20只健康的AA肉雞隨機分為口服組和靜脈給藥組，每組10只，兩組分別按10 mg/kg b.w灌服和靜注酒石酸泰樂菌素溶液。所有肉雞在給予酒石酸泰樂菌素后24 h內(nèi)從翅下靜脈采血，HPLC法測定泰樂菌素的血

3、藥濃度，3P97藥動學軟件分析藥-時數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示:建立的HPLC方法符合定量檢測要求，肉雞單劑量口服酒石酸泰樂菌素的藥動學過程符合一室開放動力學模型，靜注后的藥動學符合二室開放動力學模型?？诜剖崽肪睾蟮乃帟r曲線下面積(AUC)為0.79±0.11μg/mL·h，達峰時間(Tpeak)為1.33±0.18h;靜注酒石酸泰樂菌素后的AUC為6.82±0.56μg/mL·h。口服給藥后的生物利用度(F)為11.58％。結(jié)果表明，雞口

4、服酒石酸泰樂菌素后，吸收迅速，生物利用度很低。
　　2.酒石酸泰樂菌素在肉雞體內(nèi)肝腸首過效應的定量評價
　　旨在研究不同給藥途徑對肉雞口服酒石酸泰樂菌素生物利用度的影響，定量評價肝腸首過效應。40只健康AA雄性肉雞隨機分為口服給藥組、十二指腸給藥組、門靜脈給藥組和靜脈給藥組，每組10只。所有肉雞在麻醉后，以10 mg/kg劑量按以上給藥方式給予酒石酸泰樂菌素溶液，所有肉雞在給藥后24 h內(nèi)從翅下靜脈采血，HPLC法測定酒石酸

5、泰樂菌素的血藥濃度，用3P97藥動學軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示:肉雞單劑量口服和十二指腸給藥后，酒石酸泰樂菌素的藥動學過程符合一室開放動力學模型，門靜脈和靜脈注射給藥后，酒石酸泰樂菌素的藥動學過程符合二室開放動力學模型。各組的曲線下面積(AUC)分別為0.78±0.03，0.86±0.05，4.77±1.13，6.57±0.43(μg/mL)·h，門靜脈給藥組的AUC顯著高于十二指腸組，靜脈給藥組的 AUC顯著高于門靜脈給藥組。表明酒石酸泰

6、樂菌素在肉雞內(nèi)存在嚴重的腸道和肝臟首過效應，腸道影響最大，達82％，其次為肝臟達27％。
　　3.酒石酸泰樂菌素在腸道中吸收轉(zhuǎn)運的研究
　　建立Caco-2單層細胞體外轉(zhuǎn)運模型和腸道灌流模型，研究酒石酸泰樂菌素在腸細胞的吸收轉(zhuǎn)運特點。Caco-2單層細胞體外轉(zhuǎn)運模型中，考察孵育時間、酒石酸泰樂菌素添加濃度、添加EGTA和抑制P-gp等對酒石酸泰樂菌素吸收轉(zhuǎn)運的影響。腸道灌流模型中，通過添加EGTA和抑制P-gp，分別對十二指

7、腸、空腸和回腸進行單向灌流，考察酒石酸泰樂菌素吸收的主要腸段、主要方式和P-gp對酒石酸泰樂菌素轉(zhuǎn)運的影響。結(jié)果顯示，酒石酸泰樂菌素在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運呈現(xiàn)細胞旁轉(zhuǎn)運和跨細胞轉(zhuǎn)運并存，EGTA的存在會使轉(zhuǎn)運系數(shù)劇增，而且體外細胞轉(zhuǎn)運試驗的轉(zhuǎn)運系數(shù)分別為2.75±0.17，7.88±0.64和4.53±0.53，6.13±1.55，表明存在外排，抑制P-gp后外排減弱，通過轉(zhuǎn)運系數(shù)推測腸道的吸收效率在20％～70％。而在小腸灌流過程

8、中，十二指腸吸收迅速，是主要吸收腸段，在腸道的吸收以跨細胞轉(zhuǎn)運為主，EGTA的存在難以提高吸收效率，維拉帕米的存在可以顯著降低P-gp介導的外排，通過各腸段的轉(zhuǎn)運系數(shù)推測在十二指腸吸收良好，而在空腸和回腸的吸收一般。表明酒石酸泰樂菌素在腸道的主要吸收腸斷是十二指腸，主要吸收方式是跨膜轉(zhuǎn)運，且P-gp參與了酒石酸泰樂菌素在腸道的外排轉(zhuǎn)運。
　　4.酒石酸泰樂菌素在肝細胞中代謝消除的研究
　　利用本實驗室建立的肝原代細胞體外代謝

9、模型，研究酒石酸泰樂菌素在肝臟細胞內(nèi)的代謝消除。考察孵育時間、肝細胞接種密度、酒石酸泰樂菌素添加濃度和抑制CYP1A、3A等因素，對酒石酸泰樂菌素代謝消除的影響。結(jié)果顯示，酒石酸泰樂菌素在肝細胞中存在著代謝消除，而且有時間依賴性和濃度依賴性，符合酶促動力學特征。體外代謝消除過程中，60 min內(nèi)，有約20％的酒石酸泰樂菌素被代謝消除，抑制CYP3A后，代謝消除的酒石酸泰樂菌素下降到10％，抑制CYP1A后，酒石酸泰樂菌素的代謝消除無明顯

10、變化。結(jié)果表明，CYP3A參與了酒石酸泰樂菌素在肝臟細胞的代謝消除，其通過代謝消除導致的首過效應降低酒石酸泰樂菌素的口服生物利用度。
　　5.酒石酸泰樂菌素對肝臟和腸細胞中CYP1A、3A和P-gp表達的影響
　　利用建立的肝原代細胞模型和Caco-2模型，進行酒石酸泰樂菌素對CYP1A、CYP3A和P-gp表達影響的體外研究，同時在雞體內(nèi)進行體內(nèi)研究。體外研究各細胞都分為4組，分別為高劑量組(50μg/mL)、中劑量組(3

11、0μg/mL)、低劑量組(10μg/mL)和空白對照組，連續(xù)作用96 h后取樣，熒光定量PCR檢測mRNA水平變化，western-blot檢測蛋白水平變化。體內(nèi)研究分為兩組，酒石酸泰樂菌素組和空白對照組，每組6羽，試驗組連續(xù)7天按10 mg/kg體重灌服酒石酸泰樂菌素溶液，對照組灌服等量生理鹽水，肉雞繼續(xù)飼喂不合任何藥物的飼料。7天后取每只雞的肝、十二指腸、空腸和回腸，熒光定量PCR和western-blot檢測。結(jié)果顯示，肝原代細胞

12、中，10μg/mL和30μg/mL的酒石酸泰樂菌素顯著抑制CYP1A和CYP3A的表達，是通過抑制其mRNA的表達進而抑制其蛋白的表達，50μg/mL的酒石酸泰樂菌素對CYP1A和CYP3A的表達無明顯影響;Caco-2細胞中，高、中和低濃度的酒石酸泰樂菌素都抑制P-gp的表達;在雞體內(nèi)，酒石酸泰樂菌素對CYP3A在雞體內(nèi)各組織的mRNA和蛋白的表達皆呈現(xiàn)顯著性抑制，而對CYP1A在肝臟和十二指腸呈現(xiàn)抑制，在肝臟的mRNA水平表達呈顯著

13、抑制，在十二指腸的蛋白水平表達呈顯著抑制，酒石酸泰樂菌素對肝內(nèi)P-gp在mRNA水平的表達呈現(xiàn)顯著抑制。表明酒石酸泰樂菌素在雞體內(nèi)連續(xù)用藥后會對CYP1A、3A和P-gp的表達呈現(xiàn)一定的抑制作用，進而影響其自身藥動學特征或引起藥物相互作用。
　　6.提高泰樂菌素口服生物利用度方法的探討
　　為了提高泰樂菌素在健康AA肉雞體內(nèi)的口服生物利用度。試驗選用140羽健康AA肉雞，體重1.5±0.1 kg，隨機平均分為7組。分別從成鹽

14、形式、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和抑制首過效應三個方面考察對泰樂菌素口服生物利用度的影響。其中成鹽形式包括磷酸泰樂菌素組和酒石酸泰樂菌素組。兩組分別按10 mg/kg.bw（以泰樂菌素計）進行單劑量灌服和靜注磷酸泰樂菌素溶液和酒石酸泰樂菌素溶液;結(jié)構(gòu)優(yōu)化包括酒石酸泰樂菌素組和酒石酸泰萬菌素組，如上分別口服和靜注給藥。抑制首過效應分為酮康唑組、維拉帕米組和空白對照組。這3組肉雞在誘導3d后分別口服和靜注酒石酸泰樂菌素。采用HPLC法測定血漿中泰樂菌素和乙酰

15、異戊酰泰樂菌素的藥物濃度，用3p97藥動學計算軟件處理血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，得出藥代動力學參數(shù)及生物利用度。結(jié)果顯示:成鹽形式方面，靜注后藥動參數(shù)相一致，口服磷酸泰樂菌素和酒石酸泰樂菌素后血漿中顯著變化參數(shù)Cmax分別為0.09±0.01和0.22±0.09μg/mL，AUC分別為0.56±0.082和0.89±0.12μg/mL·h，F(xiàn)分別為8.47％和12.92％，說明口服酒石酸泰樂菌素比口服磷酸泰樂菌素吸收好，口服生物利用度得到提高

16、;結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面，顯著變化參數(shù)如下，靜注酒石酸泰萬菌素和酒石酸泰樂菌素后，Vd分別為0.61±0.07和0.29±0.04 L/kg，T1/2ke分別為1.98±0.21和1.50±0.21 h，口服后，Tpeak分別為0.76±0.38和1.87±0.38 h，AUC分別為1.15±0.12和0.82±0.16，T1/2ke分別為1.86±0.44和1.46±0.44 h，F(xiàn)分別為12.6％和16.7％，說明酒石酸泰萬菌素吸收快、分布廣