酒石酸衍生的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料的制備及其基因轉(zhuǎn)染活性研究.pdf

1、目的：
　　基因治療需要高效安全的載體系統(tǒng)將基因遞送到靶細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)?；蛑委熭d體主要分為病毒載體與非病毒載體兩大類。非病毒載體因其負(fù)載量大，穩(wěn)定性和安全性高，易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，成為目前基因載體研究的熱點(diǎn)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是目前研究最為廣泛的非病毒載體，在基因治療中具有廣闊的發(fā)展與應(yīng)用前景。本論文以酒石酸為骨架，通過在酒石酸羥基端引入氨基己酸為陽(yáng)離子頭部，在其羧基端引入不同長(zhǎng)度的疏水鏈制備得到新型骨架的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，以期為基因

2、治療提供高效低毒的載體。
　　方法：
　　以 L-（+）-酒石酸，6-氨基己酸，長(zhǎng)鏈烷基胺或醇（辛胺，十二胺，十六胺，辛醇，十二醇，十六醇）等為原料，構(gòu)建了單鏈陽(yáng)離子脂質(zhì)材料（TS1-TS3）和雙鏈陽(yáng)離子脂質(zhì)材料（TD1-TD3）。采用質(zhì)譜、核磁、紅外等方法對(duì)合成的材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　將上述脂質(zhì)材料與輔助脂質(zhì) DOPE按照一定比例混合，采用薄膜分散法制備得到陽(yáng)離子脂質(zhì)體并對(duì)其進(jìn)行表征和細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。
　　采用

3、凝膠電泳阻滯方法考察所得6種陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的復(fù)合能力和核酶降解保護(hù)作用，為基因轉(zhuǎn)染篩選適宜的N/P比。以293T細(xì)胞和報(bào)告基因pEGFP-N1為模型，采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對(duì)上述陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。對(duì)初篩轉(zhuǎn)染活性較好的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料進(jìn)行處方優(yōu)化，并進(jìn)一步考察其在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染活性。選用不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑抑制劑觀測(cè) TD2/DNA復(fù)合物的入胞機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　設(shè)計(jì)合成了6種基于L-（+）

4、-酒石酸的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，包括3種單鏈陽(yáng)離子脂質(zhì)材料TS1-TS3和3種雙鏈陽(yáng)離子脂質(zhì)材料TD1-TD3，經(jīng)1H NMR，MS和IR等方法鑒定，所得脂質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)與目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)一致。
　　陽(yáng)離子脂質(zhì)體粒徑及zeta電位測(cè)定結(jié)果表明，所制備的6種陽(yáng)離子脂質(zhì)體粒徑均小于150nm，zeta電位均在35 mV以上，滿足基因遞送載體的要求。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料毒性較低，具有較好的生物相容性，上述陽(yáng)離子脂質(zhì)體除

5、TD1外，IC50均大于陽(yáng)性對(duì)照DOTAP。
　　凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在N/P比小于3的情況下，所制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體均能與DNA完全復(fù)合，具有較強(qiáng)的攜載DNA能力。6種載體材料在293T細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染活性測(cè)定結(jié)果表明，單鏈陽(yáng)離子脂質(zhì)材料TS1-TS3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染活性均較差，與裸DNA幾乎無差異。雙鏈陽(yáng)離子脂質(zhì)材料TD1轉(zhuǎn)染能力較弱，TD2和TD3具有較好的轉(zhuǎn)染活性。TD2和TD3的進(jìn)一步處方優(yōu)化結(jié)果顯示，最優(yōu)脂質(zhì)材料/DOPE比

6、例分別為1:0.5和1:2；最優(yōu)N/P比均為1:1。與陽(yáng)性對(duì)照DOTAP相比，TD2（MFI153.3±14.7）和TD3（MFI190.5±7.8）的平均熒光強(qiáng)度與DOTAP（MFI171.1±14.5）無顯著性差異，但TD2（47.7％±7.0%）與TD3（32.9%±2.0%）兩者的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于DOTAP（24.7%±1.8%；P<0.01），具有更好的轉(zhuǎn)染活性。HeLa細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TD2（MFI53.8

7、±6.2）和TD3（MFI54.7±2.0）的平均熒光強(qiáng)度雖小于DOTAP（MFI98.0±1.8，P<0.01），但TD3（19.6%±0.9%）的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與DOTAP（18.3%±0.9%）相當(dāng)，TD2（25.6%±0.4%）的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分?jǐn)?shù)仍優(yōu)于DOTAP，具有較強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)染能力。TD2/DNA復(fù)合物入胞機(jī)制研究結(jié)果表明，TD2與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞。
　　結(jié)論:
　　本論文在

8、 L-（+）-酒石酸骨架中引入6-氨基己酸作為陽(yáng)離子頭部，引入不同長(zhǎng)度的疏水鏈分別構(gòu)建了單鏈與雙鏈?zhǔn)杷膊康?種陽(yáng)離子脂質(zhì)材料并對(duì)其細(xì)胞毒性和基因轉(zhuǎn)染活性進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，除TD1外，上述陽(yáng)離子脂質(zhì)材料所得基因載體具有粒徑均一，細(xì)胞毒性小，攜載和保護(hù)DNA能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其中TD2陽(yáng)離子脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染能力最強(qiáng)，在293T和HeLa細(xì)胞系上均顯示很好的轉(zhuǎn)染活性，且TD2與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞，該途徑可以避