丹參水溶性成分丹參素與熊果酸對瑞舒伐他汀基于OATP1B1介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)攝取的影響與分子機(jī)制.pdf

1、背景:
　　 他汀類藥物常用于高脂血癥及其并發(fā)癥如冠心病,動脈粥樣硬化的治療。丹參為傳統(tǒng)中藥,用于心腦血管疾病的治療,并常與他汀類藥物合用于治療高脂血癥及心腦血管疾病,但丹參是否影響瑞舒伐他汀的藥代動力學(xué)過程尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)丹參水溶性成分丹參素與熊果酸均為OATP1B1或大鼠同源性轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatp1b2的底物,而他汀藥物大多是OATP1B1/Oatp1b2底物,因此丹參素、熊果酸是否影響OATP1B1/Oatp1b2對他汀藥物

2、的轉(zhuǎn)運(yùn)而影響其藥代動力學(xué)特征?這值得探索。本課題旨在初步探索大鼠體內(nèi)丹參素與熊果酸對瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)影響的基礎(chǔ)上,建立Caco-2細(xì)胞單層模型與大鼠原代肝細(xì)胞模型,以探究丹參素與熊果酸在模型中對瑞舒伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)與攝取的影響；通過構(gòu)建分別穩(wěn)定表達(dá)OATP1B1*1a與OATP1B1*5的HEK293T細(xì)胞模型,以O(shè)ATP1B1參與諸多藥物的肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)為切入點,并基于OATP1B1遺傳多態(tài)性現(xiàn)象,在分子水平考察丹參素與熊果酸分別對野生型與突

3、變型OATP1B1介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)瑞舒伐他汀的影響,探明丹參素、熊果酸對OATP1B1介導(dǎo)瑞舒伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)的影響機(jī)制。
　　 目的:
　　 1、在大鼠體內(nèi)研究丹參素、熊果酸分別對瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)的影響。
　　 2、探明丹參素與熊果酸分別對瑞舒伐他汀在Caco-2細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 3、研究丹參素與熊果酸分別對原代肝細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀的影響。
　　 4、構(gòu)建分別穩(wěn)定表達(dá)OATP1B1*1a與OA

4、TP1B1*5的HEK293T細(xì)胞模型,在分子水平研究丹參素、熊果酸對表達(dá)OATP1B1*1a、OATP1B1*5的HEK293T細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀的影響,明確丹參素、熊果酸對OATP1B1介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)瑞舒伐他汀的抑制作用,探明丹參素、熊果酸影響瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)特征的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、將雄性SD大鼠(220±15g),分為對照組、瑞舒伐他汀合用丹參素組與瑞舒伐他汀合用熊果酸組,每組6只,以瑞舒伐他汀10

5、0mg/kg、丹參素100mg/kg和熊果酸80mg/kg的劑量灌胃給藥,兩藥合用時先給丹參素(或熊果酸)后瑞舒伐他汀相繼灌胃,間隔15min,在瑞舒伐他汀灌胃給藥前與給藥后0.5,1,1.5,3,5,8,10,12,24h眼眶靜脈采血約0.3ml,血樣置于事先加入肝素鈉的試管中,離心處理后,血漿樣品置于-20℃冰箱凍存,應(yīng)用LC-MS方法測定大鼠血漿中瑞舒伐他汀藥物濃度；通過DAS2.1軟件對瑞舒伐他汀的血藥濃度進(jìn)行藥代動力學(xué)分析,應(yīng)

6、用SPSS12.0對藥代參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 2、建立Caco-2單層細(xì)胞模型,運(yùn)用TEER值與堿性磷酸酶活力考察模型完整性與極性；在探明瑞舒伐他汀、維拉帕米、丹參素與熊果酸對Caco-2毒性作用基礎(chǔ)上,研究Caco-2細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取特點,研究維拉帕米、熊果酸與丹參素分別對瑞舒伐他汀在Caco-2單層細(xì)胞模型中的表觀滲透系數(shù)PappBL-AP與PappAP-BL的影響,應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　

7、 3、采用原位膠原酶灌流法分離大鼠原代肝細(xì)胞；探明瑞舒伐他汀、丹參素與熊果酸對大鼠原代肝細(xì)胞毒性作用基礎(chǔ)上,探索大鼠原代肝細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取特點,研究丹參素和熊果酸分別對大鼠原代肝細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀的影響:DMEM培養(yǎng)基將肝細(xì)胞懸液稀釋為1×106/ml,加入到24孔培養(yǎng)板內(nèi),實驗設(shè)計分為空白組,瑞舒伐他汀對照組,瑞舒伐他汀合用系列濃度的丹參素或熊果酸組,加藥后瑞舒伐他汀的藥物終濃度為20uM,系列丹參素終濃度分別為20,40與80

8、 uM,系列熊果酸終濃度分別為4,8與16 uM,加完藥后置37℃的培養(yǎng)箱中分別孵肓40sec,緩慢吸棄含藥的培養(yǎng)液,加入培養(yǎng)液洗滌四次后加入0.5ml無菌水于-80℃超低溫冰箱反復(fù)凍溶3次,樣本經(jīng)處理后LC-MS測定。應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 4、采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain reaction,PCR)從目的質(zhì)粒OATP1B1*5 Plasmid(pcDNA3.1(-)/Zeo:Invit

9、rogen)中釣取目的基因OATP1B1*5,并以此為模板通過點突變克隆出另一目的基因OATP1B1*1a,并經(jīng)測序鑒定；以攜帶綠色熒光蛋白(Gteen fluorescent protein,GFP)的pGC-FU慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介,分別構(gòu)建OATP1B1*1a-GFP融合基因與OATP1B1*5-GFP融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體,通過觀察熒光及Western blot檢測GFP蛋白表達(dá)；實時熒光定量PCR(Real-

10、time quantitative PCR,RTQ-PCR)檢測慢病毒滴度；將攜帶OATP1B1-GFP融合基因的慢病毒(Lenti-OATP1B1*1a,Lenti-OATP1B1*5)及僅攜帶GFP的慢病毒(Lenti-GFP)感染HEK293T,通過觀察熒光及Western blot檢測目的基因OATP1B1*1a與OATP1B1*5的表達(dá),建立穩(wěn)定表達(dá)OATP1B1*1a與OATP1B1*5的HEK293T細(xì)胞模型。探明瑞舒伐他

11、汀、丹參素與熊果酸對HEK293T的細(xì)胞毒性作用基礎(chǔ)上,研究OATP1B81*1a-HEK293T與OAT1P1B1*5-HEK293T細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取特點,探索丹參素和熊果酸分別對表達(dá)OATP1B1*1a與OATP1B1*5的HEK293T細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀的影響:實驗設(shè)計為空白組,瑞舒伐他汀組,系列濃度丹參素(0.1,1與10 uM)或熊果酸(0.18,1.8與18 uM)合用瑞舒伐他汀組；在細(xì)胞攝取實驗中,瑞舒伐他汀的藥物濃

12、度是10 uM,采用LC-MS測定HEK293T細(xì)胞樣本。SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、熊果酸與丹參素均可明顯影響大鼠體內(nèi)瑞舒伐他汀的藥代動力學(xué)特征,合用丹參素或熊果酸后,大鼠體內(nèi)瑞舒伐他汀的Cmax、AUC0-t、AUC0∞參數(shù)值均明顯增加,而清除速率CLz/F則明顯降低。與單用瑞舒伐他汀相比較,合用丹參素后瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞分別增加約122.59％、

13、193.62％和195％,而CLz/F值降低了60％；合用熊果酸后瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞分別增加約163.02％、145.99％和157.55％,而CLz/F值降低了57.84％。
　　 2、Caco-2細(xì)胞生長良好均勻,邊界清晰,細(xì)胞緊密連接且完整；隨著培養(yǎng)時間的增加,Caco-2細(xì)胞的TEER值也隨之增大,在培養(yǎng)21-24天后TEER>500Ω.cm-2,同時Caco-2細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的

14、極化現(xiàn)象,建立了可靠的Caco-2細(xì)胞單層模型；Caco-2細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取與時間和濃度相關(guān),但HBSS培養(yǎng)液的PH值無影響；P-gp專屬性抑制劑維拉帕米、P-gp的底物熊果酸與丹參素和瑞舒伐他汀合用時,并不影響瑞舒伐他汀在Caco-2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn),對其表觀滲透系數(shù)(Papp)及其表觀滲透率(PDR)的影響無統(tǒng)計差異。
　　 3、成功建立了大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法；大鼠原代肝細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取在0～40sec迅

15、速增加,80sec后開始平緩并逐漸趨于穩(wěn)態(tài)；瑞舒伐他汀藥物濃度在5-20uM范圍內(nèi),原代肝細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取隨藥物濃度增加而基本呈線性增加,當(dāng)濃度達(dá)到60uM時,肝細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取趨于飽和,肝細(xì)胞對瑞舒伐他汀的攝取動力學(xué)參數(shù)Km與Vmax分別為25.11±8.49 uM與16.97±2.19 nmol min-1 mg-1 protein；20、40與80uM的丹參素對肝細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀均有抑制作用,并使其攝取分別減少了3.

16、13％、41.15％與74.62％；丹參素濃度為40uM和80uM時對肝細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀有顯著的抑制作用,而丹參素濃度為20uM時抑制作用輕,抑制參數(shù)IC50為53.04±2.43uM。4、8與16uM的熊果酸均對肝細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀產(chǎn)生抑制作用并使瑞舒伐他汀的攝取分別減少了1.70±0.94％、47.58±1.80％與71.16±0.19％,熊果酸在濃度為8uM和16uM時對瑞舒伐他汀在肝細(xì)胞的攝取有明顯的抑制作用,但其濃度為4uM

17、時未表現(xiàn)出明顯抑制作用,抑制參數(shù)IC50為10.88±0.29uM。
　　 4、分別構(gòu)建的OATP1B1*1a-GFP融合基因與OATP1B1*5-GFP融合基因重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞后可正常表達(dá)；重組慢病毒(Lenti-OATP1B1*1a,Lenti-OATP1B1*5)滴度是2x107TU/ml；Lenti-OATP1B1*1a,Lenti-OATP1B1*5感染 HEK293T后熒光表達(dá)隨著時間延長及感

18、染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)值增加而增強(qiáng)、增多；最佳MOI值為50；MOI為50時,Lenti-OATP1B1*1a,Lenti-OATP1B1*5轉(zhuǎn)染HEK293T的轉(zhuǎn)染率達(dá)80％。研究顯示OATP1B1對瑞舒伐他汀的轉(zhuǎn)運(yùn)作用與基因型有關(guān),相對于野生型OATP1B1*1a,突變型OATP1B1*5的轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯減弱,OATP1B1*5-HEK293T攝取顯著少于OATP1B1*1a-HEK293

19、T(P<0.05)；OATP1B1*1a-HEK293T對瑞舒伐動力學(xué)攝取的動力學(xué)參數(shù)Km與Vmax分別為19.87±5.96 uM與6.63±0.70pmol min-1 mg-1 protein:OATP1B1*5-HEK293T對瑞舒伐動力學(xué)攝取的動力學(xué)參數(shù)Km與Vmax分別為10.05±4.02 uM與2.58±0.30 pmol min-1 mg-1 protein；丹參素對OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)瑞舒伐他汀的抑制與OATP1B1基

20、因型有關(guān),對突變型OATP1B1*5的轉(zhuǎn)運(yùn)表現(xiàn)出明顯的競爭抑制作用,藥物濃度為1與10uM時對轉(zhuǎn)運(yùn)瑞舒伐他汀分別減少了39.11±4.94％和63.61±3.94％,抑制參數(shù)IC50為3.26±0.54uM,而當(dāng)OATP1B1為野生型OATP1B1*1a時,丹參素的抑制作用較輕,0.1,1與10uM的丹參素對OATP1B1*1a轉(zhuǎn)運(yùn)瑞舒伐他汀分別減少了3.96±3.40％,8.22±2.40％,11.56±3.04％；熊果酸藥物濃度為1

21、.8uM與18uM時,對OATP1B1*1a與OATP1B1*5轉(zhuǎn)運(yùn)瑞舒伐他汀均產(chǎn)生明顯的競爭抑制作用,對OATP1B1*1a的轉(zhuǎn)運(yùn)分別減少了34.60±2.99％與66.08±1.83％,而對OATP1B1*5的轉(zhuǎn)運(yùn)分別減少了34.27±7.08％與66.95±1.14％,熊果酸對OATP1B1*1a與OATP1B1*5轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制參數(shù)IC50分別為6.25±0.42uM與6.07±0.57uM。
　　 結(jié)論:
　　 1

22、、丹參素與熊果酸均可影響瑞舒伐他汀在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征:瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax與AUC顯著增大,而清除速率CLz/F顯著降低(P<0.05)。
　　 2、瑞舒伐他汀在Caco-2細(xì)胞模型中以主動轉(zhuǎn)運(yùn)和被動擴(kuò)散兩種機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)；瑞舒伐他汀不是P-gp的底物；Caco-2單層細(xì)胞模型建立的腸道藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的體外模型中,熊果酸與丹參素對瑞舒伐他汀的吸收無影響。
　　 3、丹參素與熊果酸均可競爭抑制原代肝細(xì)胞對瑞舒伐他汀