丹參水溶性成分——丹參多酚酸鹽對血小板活化的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、丹參的有效成分為脂溶性和水溶性兩大類，在水溶性成分中，以丹酚酸B(Sal-B)（占80％以上）為主要成分的丹參多酚酸鹽，目前被臨床廣泛應(yīng)用于血栓性疾病的治療，療效確切。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)其可以抑制血小板聚集率，但是具體作用機(jī)制尚不明確，我們推斷這種療效與抑制血小板活化有關(guān)，擬采用以下臨床及基礎(chǔ)研究進(jìn)行證實(shí)，其作用機(jī)制的闡明對于丹參的臨床應(yīng)用及開發(fā)新藥均具有重要意義。
　　目的:本研究觀察丹參多酚酸鹽對急性冠脈綜合癥(ACS)患者血小

2、板活化標(biāo)志糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(PAC-1)、血小板P選擇素(CD62p)的影響，通過體外研究主要成分Sal-B對健康人血小板P2Y12受體后信號通路的影響，以臨床與實(shí)驗(yàn)室結(jié)合的方法闡明丹參多酚酸鹽抗血小板活化的具體藥理作用部位。
　　方法:入選患者分為實(shí)驗(yàn)組:標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上加用注射用丹參多酚酸鹽組200 mg/天;對照組:標(biāo)準(zhǔn)治療組。標(biāo)準(zhǔn)治療指根據(jù)指南使用腸溶阿司匹林和氯吡格雷（首劑予以負(fù)荷量口服后，繼續(xù)以0.1 g/天和75 mg

3、/天維持）、阿托伐他汀鈣片、依諾肝素鈉等。流式細(xì)胞儀測定血小板靜息狀態(tài)以及激動劑活化后表面PAC-1、CD62p表達(dá)，觀察丹參多酚酸鹽對ACS患者血小板活化的影響。在體外，通過Sal-B與人血小板懸浮液孵育，利用激動劑凝血酶，二磷酸腺苷(ADP)，膠原蛋白(COL)，血栓素類似物U46619或花生四烯酸（AA）刺激，篩選出血小板G蛋白偶聯(lián)P2Y1、P2Y12受體后信號通路為可能作用靶點(diǎn)。利用熒光分光光度儀檢測Sal-B對血小板Gq蛋白偶

4、聯(lián)P2Y1受體后胞內(nèi)Ca+釋放的影響;利用血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)的印跡磷酸化檢查，放射免疫法測定細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量來檢測Sal-B對Gi蛋白偶聯(lián)P2Y12受體后信號影響。ADP與P2Y12受體之間的相互作用直接利用了原子力顯微鏡(AFM)的物理方法。
　　結(jié)果:臨床研究共納入病例63人，實(shí)驗(yàn)組32人，對照組31人。治療后兩組血小板基礎(chǔ)狀態(tài)PAC-1和CD62P的表達(dá)比例均較治療前下降，組間比較沒有顯著差異

5、;使用ADP誘導(dǎo)血小板活化后，實(shí)驗(yàn)組血小板PAC-1表達(dá)低于對照組(47.05±10.04％比52.06±6.18％，P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組血小板CD62P表達(dá)低于對照組（39.48±8.33％比45.04±6.68％,P＜0.01）。
　　體外實(shí)驗(yàn)中，Sal-B可以阻斷由0.5 mM AA，1μMU46619，0.05 U/ml凝血酶或者2μg/mL COL誘導(dǎo)的血小板聚集。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Sal-B對以ADP為激動劑誘導(dǎo)的血小板

6、聚集有較好的抑制作用，70μM Sal-B可以抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集60％。通過對血小板G蛋白偶聯(lián)P2Y1、P2Y12受體后信號通路進(jìn)行分別檢測，在螯合細(xì)胞外鈣的前提下，Sal-B不能抑制P2Y1下游細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，但是可以明顯增加P2Y12下游VASP的磷酸化。
　　在此研究基礎(chǔ)上，我們檢測了P2Y12受體下游信號分子cAMP水平的變化。結(jié)果顯示Sal-B可以逆轉(zhuǎn)激動劑ADP誘導(dǎo)的cAMP下降，并且減少靜息狀態(tài)下血小板胞內(nèi)

7、cAMP降解，提示具有抑制磷酸二酯酶(PDE)活性的作用。血小板胞內(nèi)的PDE具有降解cAMP的作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sal-B能夠直接抑制PDE酶活性，證明Sal-B還可以通過抑制PDE酶活性，降低cAMP降解而發(fā)揮抗血小板作用。
　　原子力顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)Sal-B的加入可以直接減小ADP與P2Y12受體之間的作用力，從而直接證明Sal-B具有P2Y12受體拮抗劑的作用。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明在接受氯吡格雷和阿司匹林雙聯(lián)治療的AC