丹參水溶性成分均勻設(shè)計(jì)配伍高通量藥效篩選及機(jī)制研究.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展、環(huán)境的改變及生活水平的提高，心腦血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重地威脅公眾的健康。導(dǎo)致心腦血管疾病確切的病理生理學(xué)機(jī)理尚未明確，目前認(rèn)為由多種原因引起，并提出了多種假說(shuō)，其中有代表性的有氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、氧化型膽固醇和氧化型低密度脂蛋白學(xué)說(shuō)、細(xì)胞因子假說(shuō)、同型半胱氨酸假說(shuō)、尿酸假說(shuō)、內(nèi)皮細(xì)胞微粒假說(shuō)、血液流變學(xué)假說(shuō)等，近年來(lái)越來(lái)越多的研究資料證明，氧化應(yīng)激可能是心腦血管疾病主要的觸發(fā)因素。高血脂、高血壓、高血糖、缺血性損傷

2、等都能夠引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生。研究表明，我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參在心腦血管疾病的治療中有顯著地療效。
　　本研究以中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，受中藥復(fù)方“君臣佐使”配伍思想啟發(fā)，丹參水溶性有效成分單體采用均勻設(shè)計(jì)-高通量篩選這一創(chuàng)新的研究模式進(jìn)行最優(yōu)配比組合篩選及藥效學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)選用原兒茶醛(protocatechuic aldehyde，Y1)、原兒茶酸(protocatechuic acid，Y2)、咖啡酸(caffeic

3、acid，Y4)、丹參素鈉(sodium danshensu，Y5)、迷迭香酸(rosmarinic acid，Y3)、丹酚酸A(salvianolic acid A，Y6)、丹酚酸B(salvianolic acid B，Y7)7種丹參水溶性有效成分7個(gè)濃度水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)配伍組合，通過(guò)清除自由基實(shí)驗(yàn)、還原能力實(shí)驗(yàn)、H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞模型、血管內(nèi)皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)剝奪模型，進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)高通量藥效篩選研究，探尋其配伍規(guī)律，并將篩選出的最佳

4、組合樣品進(jìn)一步開(kāi)展腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及機(jī)制研究。
　　1丹參水溶性成分最優(yōu)配比體外篩選
　　1.1清除DPPH自由基
　　建立抗DPPH氧化活性實(shí)驗(yàn)方法，丹參水溶性成分(Y1～Y7)及不同濃度之間(10-3～10-9 mol·L-1)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)，得到14種相互作用的配比組合(A1～A14)，評(píng)價(jià)丹參水溶性有效成分配比組合對(duì)DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果顯示丹參水溶性成分各個(gè)樣品抗DPPH氧化活性作用

5、顯著，各配伍組合樣品抗DPPH作用（DPPH自由基清除率）最高A11(Y1:106mol·L-1，Y2:10-9mol·L-1，Y3:10-9mol·L-1，Y4:10-4mol·L-1，Y5:10-3mol·L-1Y6:10-3mol·L-1，Y7:10-6 mol·L-1)為（56.9±1.3）％。
　　1.2還原能力測(cè)定
　　建立還原能力測(cè)定方法，丹參水溶性成分(Y1～Y7)及不同濃度之間(10-3～10-9mol·L

6、-1)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)，得到14種相互作用的配比組合(B1～B14)，評(píng)價(jià)丹參水溶性有效成分配比組合對(duì)還原能力的影響。結(jié)果顯示丹參水溶性成分各個(gè)樣品還原能力顯著，各配伍組合還原能力最高B11(Y1:10-6mol·L-1，Y2:10-9mol·L-1，Y3:10-9mol·L-1，Y4:10-4mol·L-1，Y5:10-3mol·L-1，Y6:10-3mol·L-1，Y7:10-6mol·L-1)為（75.3±2.6）％。
　　1.

7、3對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　建立H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型。篩選丹參水溶性有效成分(Y1～Y7)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)毒劑量濃度范圍。丹參水溶性各成分及不同濃度之間(10-4～10-10 mol·L-1)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)，得到14種相互作用的組合(C1～C14)，評(píng)價(jià)丹參水溶性有效成分配比組合對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果顯示丹參水溶性成分Y2，Y4，Y5，Y7樣品對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷具

8、有一定的保護(hù)作用，最佳配伍組合C2(Y1:10-5mol·L-1，Y2:10-7mol·L-1，Y3:10-4mol·L-1，Y4:10-10mol·L-1，Y5:10-10mol·L-1，Y6:10-7mol·L-1，Y7:10-9mol·L-1)樣品的細(xì)胞存活率為（70.2±4.3）％。
　　1.4對(duì)血清剝奪血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　建立血清剝奪血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。篩選丹參水溶性有效成分(Y1～Y7)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)

9、胞無(wú)毒劑量濃度劑量范圍。丹參水溶性各成分及不同濃度之間(10-4～10-10 mol·L-1)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)，得到14種相互作用配比的組合(D1～D14)，評(píng)價(jià)丹參水溶性有效成分配比組合對(duì)血清剝奪血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示丹參水溶性成分Y1，Y2，Y5，Y6，Y7樣品對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)剝奪損傷具有一定的保護(hù)作用，最優(yōu)配比組合樣品D4(Y1:10-7mol·L-1，Y2:10-4 mol·L-1，Y3:10-4mol·L-1，Y4

10、:10-9mol·L-1，Y5:10-10mol·L-1，Y6:10-10mol·L-1,Y7:10-7mol·L-1)的細(xì)胞存活率為（76.0±3.2）％。
　　2最優(yōu)配比組合對(duì)腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及機(jī)制研究
　　驗(yàn)證體外篩選的丹參水溶性成分最優(yōu)配比組合(A11，C2，D4)對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其機(jī)制。采用改進(jìn)的Himori法暫時(shí)性阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用水迷宮

11、實(shí)驗(yàn)，觀察配伍組合樣品對(duì)腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護(hù)作用，檢測(cè)小鼠斷頭耐缺氧存活時(shí)間，腦組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase，TChE)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活力及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspara

12、te protease-3，Capase-3)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)的表達(dá)。結(jié)果顯示，配伍組合D4，A11可明顯改善小鼠腦缺血再灌注所致的記憶障礙，增強(qiáng)耐缺氧能力，提高腦內(nèi)SOD，CAT活性，降低AChE活性和MDA含量;與此同時(shí)，抑制凋亡蛋白Capase-3表達(dá)，上調(diào)NGF表達(dá)。其中以D4（2.8μmol·L-1）、A11（30μmol·L-1）組作用最為明顯(P＜0.01)，C2各個(gè)劑量組效