丹參多種有效單體均勻設計——高通量篩選及其藥效學研究.pdf

1、近些年來，社會人口老齡化問題日益加重，腦血管疾病的發(fā)病率也在逐年上升，缺血性腦血管疾病已經成為重點防治的老年性疾病之一。研究表明，我國傳統(tǒng)中藥丹參在缺血性腦病治療方面有一定療效，在缺血性腦血管疾病發(fā)病的多個環(huán)節(jié)顯示出一定的治療作用。
　　本研究采用均勻設計-高通量篩選技術這一嶄新的研究模式，對丹參多種單體的配伍組合進行高通量篩選及藥效學研究。實驗選丹參酮Ⅰ(Y1)、丹參酮ⅡA(Y2)、隱丹參酮(Y3)、二氫丹參酮Ⅰ(Y4)、原兒茶

2、醛(Y5)、原兒茶酸(Y6)、迷迭香酸(Y7)、咖啡酸(Y8)、丹參素鈉(Y9)、丹酚酸A(Y10)、丹酚酸B(Y11)、三七皂苷R1(Y12)、人參皂苷Rb1(Y13)、人參皂苷Rg1(Y14)等丹參有效單體及冰片(Y15)共15種單體成分。分組情況如下:A、a組分別含相同的7種單體成分(Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11)，其中A組各單體成分分別在1×10-3～1×10-9 mol·L-1七個濃度水平進行配伍組合，a組在1

3、×10-3、0.5×10-3、1×10-4、0.5×10-4、1×10-5、0.5×10-5、1×10-6mol·L-1七個濃度水平進行配伍組合;B、b亦分別組含有相同的7種單體成分(Y2、Y3、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15)，其中B組各單體成分分別在1×10-3～1×10-9 mol·L-1七個濃度水平進行配伍組合，b組在1×10-3、0.5×10-3、1×10-4、0.5×10-4、1×10-5、0.5×10-5、1×10

4、-6 mol·L-1七個濃度水平進行配伍組合;C、c組分別含有相同的11種單體成分(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11)，其中C組各單體分別在1×10-3～1×10-8 mol·L-1六個濃度水平進行配伍組合，c組則在1×10-3、0.5×10-3、1×10-4、0.5×10-4、1×10-5、0.5×10-5 mol·L-1六個濃度水平上進行配伍組合。
　　各組樣品按照相應均勻設計表進行配伍，得

5、到多種組合樣品。以上6組共可得到104種組合樣品，分別以A1～A14、a1～a14、B1～B14、b1～b14、C1～C24、c1～c24表示，通過清除DPPH自由基及還原能力實驗等體外抗氧化檢測方法，對所得組合樣品進行高通量藥效篩選，比較各組多種單體成分、多種濃度梯度配伍組合的抗DPPH能力和還原能力的大小，并對所得實驗結果數據進行《均勻設計與參數優(yōu)化WUST軟件包》的多元逐步回歸分析，得到優(yōu)化結果，根據優(yōu)化結果進行配伍，得到優(yōu)化組合

6、，將各組配伍組合樣品同優(yōu)化組合樣品一起，重復以上清除DPPH自由基及還原能力實驗，由實驗結果篩選出高活性組合樣品，完成對配伍組合樣品的初步藥效探索（初篩）。以神經細胞為作用靶點，通過H2O2建立海馬神經細胞損傷模型，維生素E為陽性對照，考察初篩組合樣品及優(yōu)化組合樣品對模型細胞生存率影響力的大小，對初篩結果做進一步細胞藥效學高通量篩選研究（復篩），并最終得到最佳配伍組合樣品。
　　1體外抗氧化實驗結果
　　實驗結果顯示，各配伍

7、組合樣品抗DPPH作用（DPPH自由基清除率）最高為48.92％，還原能力最高為62.26％，而脂溶性成分相對較多的B、b組抗DPPH作用及還原能力普遍較低，其中抗DPPH作用最高為38.80％，還原能力最高為33.74％。
　　2細胞學實驗結果
　　實驗結果顯示，組合樣品對神經細胞的保護作用顯著（細胞生存率＞72％，最高為94.9％），明顯高于陽性對照藥VE(細胞生存率為75.4％)。最終獲得3個最佳組合樣品a11、P1、

8、P4（細胞生存率＞90％）。
　　經過初篩和復篩，最終得到的a11、P1和P4三種最佳配伍組合，它們對損傷海馬細胞的保護作用顯著，細胞生存率大于90％，明顯高于陽性對照藥維生素E及其所含各單體在相同濃度下的細胞保護作用。結果顯示最佳配伍組合樣品抗氧化作用及細胞保護作用與它們所含有效單體的總物質的量濃度并無明顯相關性，這一結果可能與其多因素、多靶點、多作用途徑有關。研究亦表明均勻設計-高通量篩選技術適合中藥的多因素多水平藥效研究，可