FM03基因型和膽堿對(duì)雞蛋三甲胺含量影響的研究.pdf

1、本文針對(duì)含黃素單氧化酶3(FMO3)基因T239S位點(diǎn),以海蘭褐產(chǎn)蛋雞為對(duì)象,日糧添加氯化膽堿作為前體物質(zhì),從遺傳和營(yíng)養(yǎng)兩方面系統(tǒng)研究了蛋雞魚腥味綜合征的影響,旨在探討FMO3基因型和膽堿及其互作對(duì)蛋黃三甲胺含量的影響及其作用機(jī)制。
　　 試驗(yàn)一:海蘭褐蛋雞魚腥味綜合征易感基因型的測(cè)定。采用PCR-RFLP法測(cè)定了FMO3T329S突變位點(diǎn)在商品代海蘭褐殼蛋雞群體(731只)中的分布規(guī)律,分離篩選出魚腥味綜合征易感基因型的產(chǎn)蛋雞

2、,用于進(jìn)一步試驗(yàn)。測(cè)序檢驗(yàn)表明,試驗(yàn)所采用的方法能針對(duì)T329S位點(diǎn),準(zhǔn)確地分離篩選FMO3基因型。結(jié)果表明:所選海蘭褐蛋雞(n=731)中,AA(野生型)、AT(雜合型)和TT(突變型)基因型頻率分別為3.4％、76.6％和20.0％,T等位基因頻率高于A等位基因。利用Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)基因平衡狀態(tài),發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在商品代海蘭褐蛋雞群體中極顯著地偏離了平衡(P＜0.001)。
　　 試驗(yàn)二:FMO3基因型對(duì)蛋黃三

3、甲胺(TMA)沉積的影響。采用單因素設(shè)計(jì),選用已知FMO3基因型海蘭褐殼產(chǎn)蛋雞132只,按基因型分為4個(gè)處理組,每組6個(gè)重復(fù)。其中AT、TT兩種基因型各54只,每重復(fù)9只,飼喂試驗(yàn)日糧(添加2960mg/kg膽堿);AA基因型24只,分為兩個(gè)處理,每2只作為一個(gè)重復(fù),分別飼喂對(duì)照日糧(添加370mg/kg膽堿)和試驗(yàn)日糧。預(yù)飼期7天,各組飼喂對(duì)照日糧。正試期42天。分別于預(yù)飼第3天和第6天,正式試驗(yàn)的第1、2、3、4、5、6、7、10、

4、14、21、28、35和42天,每重復(fù)取3枚(AA基因型1～2枚)雞蛋,分離蛋黃,混勻,比色法測(cè)定TMA。結(jié)果表明:(1)蛋黃TMA含量隨時(shí)間呈間歇性變化。AT和TT基因型TMA含量從試驗(yàn)第3天起表現(xiàn)出間歇性上升趨勢(shì),分別于第35天和第21天時(shí)達(dá)到整個(gè)試驗(yàn)期最大值(5.02和10.53μg/g):AA基因型蛋黃TMA含量(1～2μg/g)無(wú)顯著變化;從試驗(yàn)第3天起(35天除外),TT基因型TMA含量顯著高于對(duì)照組和其他處理組(P＜0.0

5、1);(2)試驗(yàn)1～21天,TT基因型TMA含量快速增加,呈間歇性上升。將雞蛋TMA沉積量(Y,μg/g)與時(shí)間(X,1～21天)進(jìn)行曲線擬合,得到方程為:Y=0.0036X5-0.1349X2+1.7706X-0.6578(R2=0.9646);(3)2960mg/kg膽堿處理下,突變基因型蛋雞魚腥味雞蛋通過(guò)感官檢出時(shí)間為3～5天。
　　 試驗(yàn)三:基因型和膽堿對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)的影響。試驗(yàn)按基因型和膽堿水平,采用3×2因

6、子重復(fù)設(shè)計(jì),每個(gè)基因型設(shè)2個(gè)膽堿添加水平(370和2960mg/kg),共6個(gè)處理組,每組6個(gè)重復(fù),AT、TT兩種基因型各108只,每個(gè)重復(fù)9只,AA基因型24只,每2只作為一個(gè)重復(fù)。預(yù)飼期1周,試驗(yàn)期6周。以重復(fù)為單位記錄每天產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、死亡雞數(shù),每周記錄雞的耗料量一次。最后計(jì)算出1-3周,4-6周和1-6周的產(chǎn)蛋率、日采食量、平均蛋重、料蛋比和日產(chǎn)蛋重。試驗(yàn)第40～42天,每重復(fù)收集6枚雞蛋(AA基因型收集4枚),4℃保存,其中3

7、枚(AA基因型2枚)用于測(cè)定蛋品質(zhì)(保證樣品采集到測(cè)定間隔相同時(shí)間);另外3枚用于制備凍干蛋黃粉,測(cè)定蛋黃營(yíng)養(yǎng)成分。試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)產(chǎn)蛋率受基因型顯著影響(P＜0.05),AA基因型高于TT和AT基因型;添加2960mg/kg膽堿顯著降低了蛋雞日采食量(P＜0.01)、1～3周料蛋比(P=0.016),基因型與日糧膽堿添加量對(duì)產(chǎn)蛋性能無(wú)交互作用;(2)基因型對(duì)蛋品質(zhì)無(wú)顯著影響;日糧添加2960mg/kg膽堿極顯著降低了蛋黃顏色(P＜

8、0.001),與370mg/kg膽堿添加量相比,蛋殼厚度、蛋白高度和哈夫單位有所降低,但無(wú)顯著性差異;基因型及其與膽堿的交互作用不影響雞蛋品質(zhì)。
　　 試驗(yàn)四;基因型和膽堿對(duì)產(chǎn)蛋雞三甲胺代謝的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)條件同試驗(yàn)三。試驗(yàn)第7、21和42天,每個(gè)重復(fù)取3枚蛋(AA基因型2枚),分離蛋黃,混勻,-20℃保存,記錄蛋重和蛋黃重,用于測(cè)定蛋黃中TMA。于試驗(yàn)第42天,各重復(fù)取一只接近平均體重的試雞,頸靜脈放血致死。采集血樣,3

9、000r/min離心10min,分離血清,并加入0.01MHC1固定TMA,-80℃保存。解剖試雞,無(wú)菌棉線結(jié)扎盲腸后取出,4℃保存,當(dāng)天測(cè)定TMA。蛋黃TMA和盲腸食糜TMA采用比色法測(cè)定,血清TMA采用頂空氣相色譜法測(cè)定。結(jié)果表明:(1)FMO3基因型顯著影響蛋黃TMA含量,表現(xiàn)為2960mg/kg膽堿添加量下,TT基因型TMA含量極顯著高于AA和AT基因型(P＜0.001),但370mg/kg膽堿處理下,各基因型產(chǎn)蛋雞蛋黃TMA含

10、量無(wú)顯著差異;日糧膽堿添加水平對(duì)蛋黃TMA有顯著作用(P＜0.05),2960mg/kg膽堿處理下,各基因型組蛋黃TMA含量較370mg/kg膽堿處理下同基因型組均有不同程度升高;FMO3基因型和膽堿對(duì)蛋黃TMA有顯著交互作用(P＜0.05);(2)基因型對(duì)盲腸食糜和血清TMA含量無(wú)顯著影響,日糧膽堿水平極顯著提高了產(chǎn)蛋雞盲腸食糜和血清TMA含量(P=-0.001),二者無(wú)交互作用;(3)盲腸食糜TMA含量與血清TMA含量正相關(guān)(P＝0

11、.061),與蛋黃TMA含量呈顯著正相關(guān)(P＝0.048);蛋黃TMA含量與血清TMA含量無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.572),與蛋黃脂肪含量間呈顯著正相關(guān)(P=0.013)。
　　 試驗(yàn)五:基因型與膽堿對(duì)FMO3基因表達(dá)水平和FMO3酶活的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)條件同試驗(yàn)三。于試驗(yàn)第42天清晨喂料前,各重復(fù)取一只接近平均體重的試雞,頸靜脈放血致死。解剖試雞,立即取出肝臟、腎臟用冷凍的生理鹽水洗去血汁,濾紙擦干稱重,剪去結(jié)締組織,液氮冷

12、凍,置-80℃冰柜中保存,提取RNA和肝臟微粒體,分別以底物TMA和甲巰咪唑代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率(nmol per mg microsomal protein per min)作為酶活性指標(biāo)。結(jié)果表明:(1)基因型間肝臟FMO3基因表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P=0.079);高劑量膽堿極顯著降低了肝臟FMO3 mRNA表達(dá)水平,AA、AT和TT基因型分別下降了19.48％(P＞0.05)、38.10％(P＜0.05)和54.29％(P＜0.01)

13、,二者無(wú)交互作用。(2)基因型、膽堿水平及二者交互作用對(duì)腎臟FMO3mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響。(3)FMO3活性受基因型顯著影響(P=0.003),AA基因型活性最高,其次AT基因型,TT基因型最低:與370mg/kg膽堿添加水平相比,2960mg/kg添加量極顯著降低了FMO3對(duì)TMA和甲巰咪唑的代謝活性(P＜0.01)。
　　 試驗(yàn)六:基因型和膽堿對(duì)產(chǎn)蛋雞脂質(zhì)代謝和血清激素水平的影響。于試驗(yàn)第42天,每重復(fù)隨機(jī)選取1只雞,空

14、腹翅靜脈采血,離心分離血清,-20℃保存,測(cè)定血清和肝臟脂質(zhì),血清激素水平,血清一氧化氮水平和丙二醛含量。通過(guò)相關(guān)分析對(duì)血液生理生化指標(biāo)篩選,探討基因型、膽堿可能的作用方式。結(jié)果表明:(1)血清甘油三酯(P=0.038)、游離脂肪酸水平受基因型顯著影響(P=0.001);日糧中添加2960mg/kg膽堿改善了機(jī)體脂質(zhì)代謝,表現(xiàn)為降低了血清TG(P=0.038)、NEFA(P=0.001)水平,增加了HDL-C水平(P=0.06),降低了

15、產(chǎn)蛋雞肝臟中總脂肪(P=0.015)、甘油三酯含量(P=0.006),二者無(wú)交互作用。(2)產(chǎn)蛋雞血糖、血清一氧化氮含量受膽堿水平影響,隨膽堿水平增加分別下降27.49％(P＜0.001)和20.60％(P=0.15),T4水平增加26.05％(P=0.008),T4/T3提高。(3)FMO3mRNA表達(dá)水平與血清胰島素(P=0.004)、T4(P=0.041)、血糖(P=0.017)含量顯著相關(guān)。
　　 綜上所述,FMO3基因