維生素D受體基因型和單倍型對(duì)血鉛濃度的影響.pdf

1、鉛在工業(yè)上用途較廣，在生活中接觸機(jī)會(huì)也較多，鉛及其無機(jī)化合物有相似的毒性，通過呼吸道和消化道進(jìn)入體內(nèi)，吸收后進(jìn)入血液，分布于軟組織如肝、脾、腎、腦等，以后鉛在體內(nèi)重新分布，90％-95％的鉛貯存于骨骼。鉛主要由腎排出，一小部分由糞便、唾液、汗、乳汁等排出。鉛引起的中毒是一種由于鉛吸收累積而導(dǎo)致的非傳染性慢性病，成人在血鉛濃度為50-60μg/dL時(shí)如果繼續(xù)鉛暴露，會(huì)導(dǎo)致腎衰、反應(yīng)遲鈍、周圍神經(jīng)系統(tǒng)病癥、痛風(fēng)等。由于血鉛、軟組織鉛與骨骼鉛

2、處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在感染、飲酒、酸中毒等情況下，骨骼中鉛被轉(zhuǎn)運(yùn)到血液和軟組織中可引起急性中毒。鉛中毒不易治愈，其對(duì)人體的危害即使在血鉛含量降低后還會(huì)持續(xù)很長的時(shí)間。因此，鉛被美國環(huán)保署(EPA)列為前10種污染物之一。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在相同鉛暴露下，人的血鉛水平并不相同，這就引起人們對(duì)存在于鉛暴露背后更深層次的鉛中毒易感因素的思考。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因多態(tài)性與鉛毒性的關(guān)系正日益受到重視，以生物學(xué)功能相關(guān)基因作為候選基因進(jìn)

3、行關(guān)聯(lián)研究，是當(dāng)前疾病易感性研究的主要策略，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)是目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于疾病易感性研究的第三代遺傳性標(biāo)記，國內(nèi)外大量研究表明鉛中毒存在遺傳易感性差異。鉛和鈣有相似的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，鉛進(jìn)入機(jī)體后大部分沉積在骨組織中[1,2]，鉛和鈣在體內(nèi)的代謝途徑幾乎一致，吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和骨組織中各個(gè)環(huán)節(jié)都與鈣競(jìng)爭結(jié)合[3,4]，鈣和鉛在機(jī)體內(nèi)相互作用、干擾甚至競(jìng)爭，鉛中

4、毒的過程是鉛干擾了體內(nèi)鈣的動(dòng)態(tài)平衡[5,6]。同時(shí)，研究表明VDR與鈣代謝存在一定關(guān)聯(lián)[7,8]。VDR基因編碼產(chǎn)物維生素D3受體蛋白為50～60Ku的細(xì)胞內(nèi)多肽，能特異結(jié)合1，25(0H)2D3(維生素D是調(diào)節(jié)鈣的平衡重要激素作用之一，其中，1，25(0H)2D3是體內(nèi)生物活性最強(qiáng)的維生素D活性形式，作用模式與其他類固醇激素相似，均需與細(xì)胞內(nèi)的受體蛋白結(jié)合而發(fā)揮生理作用)，并作用于靶細(xì)胞核，發(fā)揮調(diào)節(jié)生物學(xué)作用：(1)鉛和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)：1，2

5、5(0H)2D3通過VDR受體介導(dǎo)的基因組活動(dòng)對(duì)小腸粘膜至少發(fā)揮一種作用，該過程可使鈣結(jié)合蛋白-D9k增加，維生素D激素可快速動(dòng)員腸道鉛和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)；(2)骨吸收和礦化：首先，1，25(OH)2D3通過VDR受體介導(dǎo)，促進(jìn)腸鉛和鈣吸收，提高血鉛和血鈣濃度，為鉛和鈣在骨中沉積，使骨礦化提供了原料，這是維生素D對(duì)骨形成的間接作用；其次，通過對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用，參與骨形成和骨吸收的代謝調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)血鈣、血鉛濃度：位于骨組織上的VDR作

6、用是雙向的，成骨細(xì)胞上的VDR可調(diào)節(jié)而位于破骨細(xì)胞上的VDR，可抑制其增殖亦可促進(jìn)其分化，從而對(duì)骨的合成和分解代謝起著雙向調(diào)節(jié)作用[9]。VDR在鈣的代謝中扮演重要作用，且據(jù)研究表明VDR等位基因與鈣代謝存在一定關(guān)聯(lián)，即不同基因型對(duì)血鈣、骨鈣的影響是不同的，同理，從理論上來說VDR基因型也會(huì)影響鉛的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝，繼而和體內(nèi)鉛暴露有一定的聯(lián)系，而且VDR基因多態(tài)性已成為鉛毒性作用的遺傳學(xué)研究焦點(diǎn)之一。
　　 研究目的：

7、　　 1.探討中國漢族人群VDR基因四種存在的SNPs等位基因、基因型分布情況；
　　 2.探討VDR基因四種存在的SNPs等位基因、基因型、單倍體和組合基因型與血鉛濃度異常易感性的聯(lián)系。
　　 研究方法：
　　 1.根據(jù)《職業(yè)病防治法》及相關(guān)法規(guī)的要求，對(duì)職業(yè)性鉛暴露者進(jìn)行定期的職業(yè)健康監(jiān)護(hù)體檢，選擇廣州市職業(yè)病防治院2009年鉛作業(yè)工人專項(xiàng)體檢中600名作業(yè)工人為研究對(duì)象，以統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)納入研究范圍，并對(duì)研究

8、對(duì)象進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)問卷調(diào)查。根據(jù)《中華人民共和國國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中《職業(yè)性慢性鉛中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(GBZ37-2002)，對(duì)血鉛≥1.9μmol/L者，收入職業(yè)病臨床科進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察。以職業(yè)性鉛暴露者血鉛＜1.9μmol/L者，為血鉛正常組，以職業(yè)性鉛暴露者血鉛≥1.9μmol/L者，為血鉛異常組。
　　 2.SNPs位點(diǎn)的選擇以及相關(guān)引物探針的設(shè)計(jì)
　　 通過查閱dbSNP數(shù)據(jù)庫、GeneBank數(shù)據(jù)庫、國際單倍體圖譜計(jì)劃、美

9、國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司軟件SNP瀏覽器及國內(nèi)外有關(guān)鉛中毒易感基因文獻(xiàn)，確定候選SNPs，采用TaqMan探針法化學(xué)熒光等位基因鑒別實(shí)驗(yàn)，引物探針委托美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司進(jìn)行合成。
　　 3.VDR SNPs與血鉛濃度異常易感性關(guān)聯(lián)的研究
　　 利用肝素抗凝管采集易感人群和耐受人群空腹靜脈血5ml/人，立即分離血漿和血細(xì)胞，血細(xì)胞用于抽提基因組DNA。采用天根公司基因組抽提試劑盒提取外周血細(xì)胞DNA并鑒定DNA的濃度和純度，采

10、用TaqMan探針法進(jìn)行等位基因鑒別，總反應(yīng)體系為25μl；擴(kuò)增過程為95℃預(yù)變性10min，92℃變性15s，60℃退火/延伸1min，40個(gè)循環(huán)。利用軟件，進(jìn)行等位基因、基因型、單倍型和組合基因型的計(jì)算和構(gòu)建。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析
　　 兩組間計(jì)量資料根據(jù)分布情況比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較根據(jù)分布情況采用方差分析或秩和檢驗(yàn)；兩組間或多組間計(jì)數(shù)資料比較采用x2檢驗(yàn)或單因素Logistic回歸分析，進(jìn)一

11、步利用多因素非條件logistic回歸模型校正混雜因素的影響。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.血鉛正常組和血鉛異常組的初步建立
　　 本研究選取廣州市職業(yè)病防治院2009年鉛作業(yè)工人專項(xiàng)體檢中600名作業(yè)工人為研究對(duì)象，并進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)問卷調(diào)查，其中男性332名，女性268名，并對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)問卷調(diào)查。共發(fā)放問卷600份，回收問卷585

12、份，其中有效問卷563份。根據(jù)《中華人民共和國國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中《職業(yè)性慢性鉛中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(GBZ37-2002)，對(duì)血鉛≥1.9μmol/L者，收入職業(yè)病臨床科進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察。以職業(yè)性鉛暴露者血鉛＜1.9μmol/L者，為血鉛正常組，以職業(yè)性鉛暴露者血鉛≥1.9μmol/L名，為血鉛異常組。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)鉛暴露強(qiáng)度情況將所有符合要求的研究對(duì)象分為高、中、低三組。三個(gè)不同的鉛暴露組，血鉛異常分布率有差異，P＜0.05，有必要校正作業(yè)環(huán)境中的

13、鉛暴露因素，考慮到低暴露組中血鉛異常組和中暴露組的樣本量不足，同時(shí)，職業(yè)性鉛高暴露作業(yè)對(duì)工人身體危害大，因此，高暴露人群的基因分布情況是本研究重點(diǎn)。
　　 2.血鉛正常組人群和血鉛異常組人群一般情況和職業(yè)有關(guān)情況
　　 鉛正常組人群274例，年齡17～57歲，平均年齡35.06±7.78歲，工齡1～13年，平均工齡3.99±2.29年；血鉛異常組人群289例，年齡18～57歲，平均年齡32.26±6.33歲，工齡1～15

14、年，平均工齡3.86±2.71年；兩組人群年齡和工齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。其中，在鉛高暴露人群中，鉛正常組人群121例，年齡17～55歲，平均年齡32.19±9.15歲，工齡1～13年，平均工齡4.10±2.97年；血鉛異常組人群256例，年齡18～57歲，平均年齡32.32±6.33歲，工齡1～15年，平均工齡4.07±2.97年；兩組人群年齡和工齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。其它計(jì)數(shù)資料分布情況，在總體或高暴露研究人群

15、中兩組的分布差異均無顯著性意義，即兩組人群的均衡性好，具有可比性。
　　 3.遺傳平衡性檢驗(yàn)
　　 血鉛正常組人群和血鉛異常組人群遺傳平衡性檢驗(yàn)，所有SNPs位點(diǎn)基因型在兩組人群中的分布均符合Hardy-Weinbery平衡，可以認(rèn)為本研究的人群處于遺傳平衡狀態(tài)并具有良好的群體代表性。
　　 4.VDR BsmI、Tru9I、ApaI和TaqI SNPs等位基因、基因型的分布情況 VDR BsmI、Tru9I、A

16、paI和TaqI SNPs等位基因之間存在連鎖不平衡性，所有SNPsMAF均大于5％。
　　 5.血鉛正常人群和血鉛濃度異常人群鉛暴露易感情況
　　 在等位基因、基因型與鉛濃度異常關(guān)系的單因素logistic回歸分析以及后續(xù)的多因素logistic回歸分析前，對(duì)不同的等位基因和基因型進(jìn)行分級(jí)賦值。
　　 結(jié)論：
　　 在中國漢族職業(yè)性鉛暴露人群中：
　　 1.VDR基因BsmI、Tru9I、Apa

17、I、TaqI四個(gè)位點(diǎn)的每個(gè)等位基因及基因型與血鉛濃度異常易感性未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。
　　 2.VDR基因的單倍型與血鉛濃度異常易感性有關(guān)。高暴露人群和研究總體中單倍型與血鉛濃度異常關(guān)系的研究結(jié)果不一致。高暴露人群中BsmI-Tru9I-ApaI-TaqI：與分布頻率最高的單倍型CCCA相比，單倍型CCAA和單倍型CTCA是血鉛濃度異常的危險(xiǎn)因素，發(fā)生血鉛濃度異常的風(fēng)險(xiǎn)高。
　　 3.VDR基因的組合基因型與血鉛濃度異常易感性有關(guān)