維生素D及其受體對RIP1的調(diào)控作用研究.pdf

1、前言：
　　受體相互作用蛋白(Receptor Interacting Protein，RIP)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以調(diào)節(jié)核因子κB的活性，是壞死信號通路中關(guān)鍵的調(diào)控因子，決定細(xì)胞生存和死亡的交叉點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)，RIP家族成員RIP1在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活及細(xì)胞程序性壞死等信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵的作用，而其功能受熱休克蛋白(HeatShock Proteins，HSPs)，泛素化等的調(diào)節(jié)。維生素D(1α，25-dihydrox

2、yvitamin D3)可以影響多種轉(zhuǎn)錄因子的信號通路，目前已有相當(dāng)多的流行病學(xué)研究結(jié)果表明，體內(nèi)維生素D水平與惡性腫瘤的發(fā)生或預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。維生素D具有抑制腫瘤等生物學(xué)功能，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究通過檢測維生素D對細(xì)胞活性及其對RIP1的mRNA和蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)維生素D可以抑制RIP1的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明此作用可能與其抑制HSP90和RIP1復(fù)合物的形成有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)將為維生素D及其受體抑制腫瘤的發(fā)生提供新的理論依據(jù)。

3、
　　目的：
　　一、檢測在小鼠成纖維細(xì)胞（mouse fibroblasts cells，L929）和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mice embryonic fibroblasts cells，MEFS）中，維生素D刺激對RIP1的蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)情況。
　　二、檢測維生素D對HSP90與RIP1相互作用形成復(fù)合物的影響，分析維生素D對細(xì)胞RIP1表達(dá)可能的調(diào)控機(jī)制，探討維生素D及其受體(Vitamin DRe

4、ceptor, VDR)通過影響RIP1介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的可能機(jī)制及其治療相關(guān)疾病的可能關(guān)系。
　　三、探索維生素D對腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響。
　　方法：
　　一、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法和免疫印跡(Westem bl

5、ot，WB)法檢測維生素D對體外培養(yǎng)MEFS、L929細(xì)胞RIP1蛋白及mRNA水平的表達(dá)影響。
　　二、應(yīng)用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，IP）法檢測維生素D對RIP1和HSP90相互作用形成復(fù)合物的影響。
　　三、應(yīng)用噻唑藍(lán)(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)比色法探索維生素D對TNF誘導(dǎo)MEFS細(xì)

6、胞死亡的影響。
　　結(jié)果：
　　一、維生素D處理L929細(xì)胞，MEFS細(xì)胞不同時間，與空白對照組比較，2hRIP1蛋白水平明顯下降。VDR-/-MEFS細(xì)胞中RIP1蛋白表達(dá)量明顯增加。RIP1mRNA水平的表達(dá)隨維生素D刺激時間的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。
　　二、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中空白對照組HSP90蛋白有表達(dá)，對比陰性對照，HSP90與RIP1相互作用，并且維生素D可抑制兩者復(fù)合物的形成。VDR-/-MEFS細(xì)胞

7、中給予格爾德霉素(geldanamycin，GA)刺激，RIP1的表達(dá)量下降。
　　三、以TNFα和蛋白合成抑制劑（Cycloheximide from microbial，CHX）處理MEFS細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明維生素D組細(xì)胞存活率明顯降低，說明維生素D可以促進(jìn)TNFα和CHX誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　結(jié)論：
　　一、維生素D能抑制RIP1蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)。
　　二、維生素D及受體可能通過調(diào)節(jié)HSP