維生素D受體在幽門螺桿菌感染中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　維生素D是一種具有廣泛生物效應(yīng)的激素載體，它除了有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育等作用之外，同時(shí)也與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。其功能主要是通過維生素D3受體（Vitamin D receptor，VDR）來介導(dǎo)，VDR為親核蛋白，屬于類固醇激素/甲狀腺受體超家族的成員。VDR與1，25(OH)2D3結(jié)合形成VDR/RXR，該復(fù)合物可與靶基因上游啟動(dòng)子區(qū)或調(diào)控區(qū)域上的特定DNA序列相結(jié)合，進(jìn)而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

2、>　　VDR參與鈣離子代謝、骨骼形成、細(xì)胞生長分化、腫瘤抑制、免疫調(diào)節(jié)等各個(gè)環(huán)節(jié)，與病原微生物感染密切相關(guān)的靶基因cathelicidin antimicrobial peptides(CAMP)的活化具有密切的相關(guān)性。CAMP除了具有抗菌活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制組織損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等功能，是宿主防御系統(tǒng)的重要成分。
　　作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，VDR是否對(duì)H.pylori感染具有免疫保護(hù)作用目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。目前認(rèn)為VD

3、R在抗感染免疫中起重要作用，可能與清除微生物感染和減輕組織損傷相關(guān)。進(jìn)一步研究VDR對(duì)細(xì)菌感染的免疫保護(hù)效果及其誘導(dǎo)的炎癥和免疫信號(hào)通路在抗感染過程中的作用具有重要意義。
　　方法:
　　1)收集門診病人胃黏膜標(biāo)本:胃鏡下活檢胃黏膜標(biāo)本兩份，一份送病理，一份液氮保存。
　　2)H.pylori感染胃黏膜上皮細(xì)胞:胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1鋪板培養(yǎng)24h之后，以不同的MOI值(MOI=0，10，50，100)與H.pylo

4、ri共培養(yǎng)24h或以MOI值為100分別共培養(yǎng)0h，6h，12h，24h。
　　3) siVDR轉(zhuǎn)染胃黏膜上皮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天，在不包含抗生素的RPMI培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度要達(dá)到30～50％。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將雙鏈siRNA導(dǎo)入到GES-1細(xì)胞。設(shè)立陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無敲低效果的VDR-negative siRNA)，實(shí)驗(yàn)組(分別轉(zhuǎn)染3對(duì)VDR siRNA)

5、。
　　4) RT-qPCR檢測(cè):抽提組織或細(xì)胞Total RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green定量PCR試劑檢測(cè)VDR、CAMP、IL-6、IL-8、CYP24A1、DEFB4mRNA的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參分析基因表達(dá)水平。
　　5) Western-Blot檢測(cè):采用Lysis buffer抽提蛋白，應(yīng)用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白變性后上樣至泳道進(jìn)行SDS-

6、PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉1h，一抗4℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記的二抗孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光后顯影、定影，最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
　　6) ELISA檢測(cè):吸取12孔培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基，5000g/min離心后，獲得的上清液按照一定比例稀釋，按照試劑說明書檢測(cè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本炎癥因子的濃度。
　　7)細(xì)菌活力檢測(cè):GES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siVDR、siCAMP或1，25(OH)2D3干預(yù)48h，然

7、后加MOI為100的H.pylori共培養(yǎng)2h，將細(xì)胞裂解倍比稀釋，以500ul稀釋液劃線涂板，培養(yǎng)3-5天后菌落計(jì)數(shù)。
　　8)統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行資料的t檢驗(yàn)、方差分析以及Person's相關(guān)分析，P＜0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1)組織水平H.pylori感染對(duì)mRNA表達(dá)水平的影響:H.pylori感染組與正常對(duì)照組比較

8、VDR、CAMP、IL-6、IL-8均表達(dá)上調(diào)，VDR mRNA水平與慢性炎癥程度呈正相關(guān)的關(guān)系(r=0.536，P＜0.001)，CAMP與VDR mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.814，P＜0.001)。
　　2)細(xì)胞感染H.pylori對(duì)VDR、CAMP表達(dá)的影響:RT-qPCR及Western-Blot結(jié)果顯示H.pylori感染組與對(duì)照組相比VDR、CAMP表達(dá)水平升高，并且具有時(shí)間和MOI值依賴性。
　　3)敲

9、低VDR基因?qū)ο掠位駽AMP以及炎癥因子的影響:VDR敲低之后，下游基因CAMP表達(dá)水平下調(diào)，DEFB4以及CYP24A1表達(dá)下調(diào)，炎癥因子IL-6、IL-8升高。
　　4)VDR激動(dòng)劑1，25(OH)2D3在H.pylori感染中的作用:1，25(OH)2D3導(dǎo)致GES-1細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)下調(diào)，抗菌肽CAMP、防御素DEFB4、CYP24A1表達(dá)升高。
　　5) siVDR、siCAMP以及1，25(O

10、H)2D3對(duì)H.pylori活力的影響:siVDR、siCAMP使GES-1抗菌活力下降，細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量增加，而1，25(OH)2D3降低活菌數(shù)量。
　　結(jié)論:
　　1)組織、細(xì)胞水平驗(yàn)證H.pylori感染導(dǎo)致VDR、CAMP、IL-6、IL-8表達(dá)上調(diào);
　　2)VDR聯(lián)合激動(dòng)劑1，25(OH)2D3具有調(diào)控下游基因抗菌肽CAMP、防御素DEFB4及CYP24A1的作用;VDR聯(lián)合激動(dòng)劑1，25(OH)2D3具有調(diào)