FoxO3a信號網(wǎng)絡在幽門螺桿菌感染中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 在全球所有與癌癥相關的死亡當中，胃癌居于第二位，并且胃癌是消化科最常見的惡性腫瘤之一。大量研究證實幽門螺桿菌感染與胃癌的發(fā)生有密切的關系。世界衛(wèi)生組織已將幽門螺桿菌列為胃癌的頭號致癌因子。全球感染幽門螺桿菌的自然人群比率超過總人口數(shù)的一半。目前，我們知道幽門螺桿菌與多種胃、十二指腸等消化道疾病有密不可分的關系，但其確切的致病機制至今尚未明確。
　　 Forkhead(Fox)蛋白家族于2000年正式發(fā)布

2、并被統(tǒng)一命名，目前被分為17個亞家族，其中對O亞家族(FoxO)的研究最為廣泛及深入，它主要通過調(diào)控下游的靶基因如Bim，p27、CyclinD1等的轉(zhuǎn)錄水平，從而在細胞凋亡、細胞周期阻滯、DNA修復及氧化應激中發(fā)揮重要作用。前期研究表明Hp可激活人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1細胞中的PI3K-Akt信號通路，進而引起細胞增殖、凋亡的紊亂。FoxO3a是Akt下游的靶分子之一，但Hp對FoxO3a的影響尚未見報道。為此，本課題圍繞Fo

3、xO3a轉(zhuǎn)錄因子在Hp相關性胃粘膜疾病中的變化展開，并探討Hp刺激對胃粘膜細胞株中FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶分子Bim，p27、CyclinD1影響。
　　 研究目的：
　　 1、研究FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子在非萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌這一胃粘膜病變過程中的變化，進而探討其臨床意義。
　　 2、研究不同濃度的Hp作用于GES-1細胞不同時間后，對細胞生長的存活率的影響；并從翻譯后蛋白表達水平及mR

4、NA水平檢測FoxO3a、pFoxO3a、p27、CyclinD1及Bim的表達，探討Hp感染對FoxO3a信號網(wǎng)絡的影響。
　　 研究方法：
　　 1、體內(nèi)研究部分
　　 選取南昌大學第一附屬醫(yī)院2007年1月至2009年9月胃鏡活檢或外科手術病理標本共149例，其中非萎縮性胃炎(ChronicNon-AtrophicGastritis，CNAG)36例，化生性萎縮性胃炎(ChronicMetaphasticA

5、trophyGastritis，CMAG)36例，異型增生(Dysplasia，Dys)38例，胃癌(GastricCancer，GC)39例為研究對象。采用免疫組織化學PV-9000二步法檢測FoxO3a及pFoxO3a的表達。
　　 2、體外研究部分
　　 (1)顯微鏡下觀察不同濃度的Hp作用于GES-1細胞后發(fā)生的形態(tài)學改變。
　　 (2)采用四唑藍(MTT)比色試驗檢測Hp按100:1、50:1及25:1

6、的濃度作用于GES-1細胞后對其存活率的影響。
　　 (3)采用western-blot蛋白印跡(WB)法檢測Hp按300:1、150:1及50:1的濃度作用于GES-1細胞后FoxO3a、pFoxO3a、p27及CyclinD1蛋白表達水平的變化。
　　 (4)采用實時定量PCR法檢測UP按300:1、150:1及50:1的濃度作用于GES-1細胞后FoxO3a、bim及p27mRNA表達水平的變化。
　　 研

7、究結果：
　　 1、體內(nèi)研究部分：
　　 (1)對Hp陽性的CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變標本中的FoxO3a進行統(tǒng)計學分析，在這四組之間無統(tǒng)計學差異(P=0.183>0.05)。在Hp陰性的CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變標本中FoxO3a進行統(tǒng)計學分析，以上四組間有統(tǒng)計學差異(P=0.018<0.05)，表現(xiàn)為FoxO3a在胃黏膜病變發(fā)展進程中呈降低趨勢，并且在同一病變階段中

8、Hp陰性組FoxO3a，的表達高于Hp陽性組。通過比較發(fā)現(xiàn)FoxO3a蛋白的表達量在Hp感染陰性與陽性組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表現(xiàn)為在Hp感染陰性組中FoxO3a蛋白呈高表達，而在Hp感染陽性組中FoxO3a蛋白呈低表達。
　　 (2)對Hp陽性CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變的標本中的pFoxO3a進行統(tǒng)計學分析，在這四組之間無統(tǒng)計學差異(P=0.088>0.05)。在Hp陰性的CNAG、CAG伴

9、IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變標本中，pFoxO3a在以上四組間有統(tǒng)計學差異(P=0.008<0.05)，表現(xiàn)為pFoxO3a在早期胃黏膜病變中呈下降趨勢，但到胃癌時呈有升高趨勢。分析pFoxO3a的表達量與Hp感染的關系結果表明，在Hp感染陽性與陰性組中pFoxO3a的表達量無明顯差異(P<0.05)。
　　 2、體外研究部分：
　　 (1)顯微鏡下觀察到Hp活菌作用于GES-1細胞24h后細胞發(fā)生典型的凋亡改變。

10、鏡下可見細胞輪廓逐漸變模糊，呈拉絲狀，有空泡形成，且更為分散，逐漸脫壁，培養(yǎng)液中可見細胞凋亡崩解后顆粒狀的產(chǎn)物。作用時間越長、作用濃度越高凋亡改變更明顯。
　　 (2)MTT檢測Hp對GES-1細胞存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)Hp活菌按不同的濃度比例作用于GES-1后在對其存活率是有影響的，有明顯的統(tǒng)計差異(P<0.05)。在100:1，50:1及25:1這三個不同濃度的Hp活菌作用于GES-1不同時間點時對細胞存活率的影響并不全都有

11、統(tǒng)計學意義，在0h時100:1的存活率明顯高于50:1組及25:1組，(P=0.004<0.05)，隨著作用濃度的降低其存活率也有所降低，在12h時細胞的存活率稍有升高，且有統(tǒng)計學意義(P=0.035<0.05)，隨著作用時間的延長，存活率迅速下降，當作用時間達48h時，100:1組的存活率明顯低于50:1級及25:1組，且有統(tǒng)計學差異(P=0.000<0.05)，其余時間點在各濃度間無明顯差異，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　

12、　 (3)Westernblot檢測Hp活菌對：FoxO3a、pFoxO3a、p27及CyclinD1蛋白表達的影響。我們觀察到Hp在按100:1及150:1的濃度作用于GES-1細胞在不同時間點FoxO3a，的表達量是有差異的(P<0.05)，具體表現(xiàn)為在0.5h時就開始呈現(xiàn)增高的趨勢，作用一段時間后達到峰值，之后呈現(xiàn)下降的趨勢，有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但是150:1組的峰值(3h)要早于100:1組(6h)，并且不難發(fā)現(xiàn)

13、在Hp作用24h后FoxO3a的表達明顯低于0h組。300:1組則未見明顯差異(P>0.05)。pFoxO3a的表達水平在這三個濃度組中均未見明顯差異(P>0.05)。P27的表達在100:1組與150:1組中均呈現(xiàn)隨作用時間延長，先升高后下降，變化趨勢與FoxO3a基本一致。100:1與150:1兩組中，不同時間點的CyclinD1表達具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表現(xiàn)為逐漸升高，但在24h時難以檢測出，在300:1組的前6h表達基

14、本一致，但12h表達量開始下降，24h亦難以檢測出。
　　 (4)Real-timePCR檢測FoxO3a在三個濃度的Hp作用時其mRNA表達量是有變化的，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，在100:1及150:1的作用濃度中FoxO3amRNA表達量隨著作用時間的延長有先增高后降低的趨勢，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，在300:1組則無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。p27mRNA在三種Hp濃度作用時其mRNA表達量的差異有統(tǒng)計學

15、意義(P<0.05)，在不同濃度作用時僅在150:1組Hp作用于GES-1是有差異的(P<0.05)，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在100:1組及300:1組中則無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，也未見明顯趨勢。BimmRNA的表達量在100:1組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其余組均無明顯差異。這一結果與Westernblot檢測的結果不盡一致，但是我們知道對于某個基因的調(diào)節(jié)也存在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)，也就是說轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平不一定是完全一致的，因

16、為存在mRNA的修飾、運輸、降解及其他一些小分子量RNA，如miRNA的調(diào)節(jié)，故某一個分子的mRNA表達量與蛋白表達量并不一定呈正相關。
　　 結論：
　　 1、FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子參與了Hp所致胃粘膜相關疾病的發(fā)生發(fā)展過程，并且與Hp的早期致病作用有關。
　　 2、不同濃度的Hp活菌作用于正常胃黏膜上皮細胞時產(chǎn)生的作用不同。低濃度的Hp可在早期發(fā)揮促凋亡的作用，晚期在各種因素的影響下產(chǎn)生促增殖作用，但高濃度的H

17、p則在早期就起著促凋亡的作用，其發(fā)揮的促凋亡作用與時間無明顯關系。
　　 3、FoxO3a與p27隨著Hp作用時間延長在正常胃黏膜上皮細胞內(nèi)的表達變化趨勢基本一致，都有先增高后降低的趨勢，但是發(fā)生改變的時間點有所不同，CyclinD1隨著作用時間延長其表達量呈下降趨勢，Bim的表達無明顯變化趨勢，但在長時間Hp的作用下表達量有所下降。因此在Hp感染的過程中。FoxO3a可根據(jù)細胞的受損程度通過調(diào)控其下游物靶基因產(chǎn)生相應的改變，從