Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路在幽門(mén)螺桿菌致病中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　 幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染約占全球人口的一半,但只有少部分的感染者發(fā)病。現(xiàn)已明確,Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃MALT淋巴瘤和胃癌的致病因子。在正常胃黏膜中,胃上皮細(xì)胞增殖和凋亡保持動(dòng)態(tài)平衡,而Hp感染能打破這一平衡,并與感染結(jié)局及致病多樣性密切相關(guān)。目前有關(guān)Hp導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞凋亡增殖的研究中,結(jié)論很不一致,甚至相互矛盾。許多體內(nèi)研究表明Hp感染既可促進(jìn)胃上皮細(xì)胞凋亡,又

2、可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,從而加速了細(xì)胞的更新,認(rèn)為和其誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)和代償性增生有關(guān)。許多體外研究報(bào)道Hp能直接誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡,但也有研究認(rèn)為Hp主要是刺激胃上皮細(xì)胞增殖,并能在早期直接激活細(xì)胞增殖信號(hào)通路,促進(jìn)DNA合成增加,從而使細(xì)胞惡變風(fēng)險(xiǎn)增加。目前體外研究所選用的大多是不同類(lèi)型的胃癌上皮細(xì)胞,而這些胃癌細(xì)胞本身在凋亡、增殖信號(hào)傳導(dǎo)等方面已存在異常。不同濃度的Hp和作用時(shí)間長(zhǎng)短的影響也不同,這可能是結(jié)果不一致的原因之一。
　

3、　 在細(xì)胞凋亡增殖的調(diào)控中,Akt-Mdm2-p53通路發(fā)揮重要作用。Akt促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡,它磷酸化Mdm2,使Mdm2穩(wěn)定和可更有效地轉(zhuǎn)位到核內(nèi),通過(guò)泛素化途徑降解p53蛋白而下調(diào)p53功能,使細(xì)胞能抗衡p53介導(dǎo)的凋亡。而Mdm2也是p53的一個(gè)靶基因,可被p53負(fù)反饋調(diào)控。同時(shí),p53可通過(guò)上調(diào)PTEN,而發(fā)揮間接抑制Akt的作用。因此,Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路在決定細(xì)胞凋亡或增殖中扮演重要角色,而它在Hp致病

4、中的作用尚不清楚。
　　 因此,針對(duì)以上研究現(xiàn)狀,本課題研究不同階段胃黏膜病變中Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和Hp感染的關(guān)系;同時(shí)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究,選用來(lái)源于人正常胃上皮細(xì)胞的GES-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象(預(yù)試驗(yàn)提示能表達(dá)野生型p53),研究Hp培養(yǎng)濾液對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡增殖的直接影響及和Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路的關(guān)系,為探討Hp的致病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、收集

5、Hp陽(yáng)性和陰性的慢性非萎縮性胃炎(CNAG)、化生性萎縮(MA)、異型增生(Dys)和胃癌(GC)胃黏膜病理標(biāo)本,行.Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)。
　　 2、制備N(xiāo)CTC11637Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)濾液,測(cè)定濃度為11.1mg/ml,以此為初濃度,稀釋不同的濃度,和GES-1細(xì)胞共培養(yǎng),設(shè)立只加Hp培養(yǎng)液的對(duì)照組,根據(jù)實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞行相應(yīng)檢測(cè)。
　　 3、Akt信號(hào)通路的阻斷:加40umol/

6、L的LY294002預(yù)處理GES-1細(xì)胞1h,設(shè)立加40umol/L的DMSO為對(duì)照組。
　　 4、相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè):
　　 (1)病理標(biāo)本Hp感染檢測(cè):采用Giemsa染色法檢測(cè)。
　　 (2)病理標(biāo)本蛋白的檢測(cè):應(yīng)用免疫組化PV-9000法檢測(cè)。
　　 (3)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè):倒置顯微鏡和電鏡觀察。
　　 (4)細(xì)胞活力的檢測(cè):采用四唑藍(lán)(MTT)比色試驗(yàn)檢測(cè)。
　　 (5)細(xì)胞周期的檢測(cè)

7、:采用PI染色流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)。
　　 (6)細(xì)胞凋亡的檢測(cè):采用DNA電泳和Annexinv/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
　　 (7)DNA損傷檢測(cè):采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)。
　　 (8)細(xì)胞mRNA的檢測(cè):采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)。
　　 (9)細(xì)胞蛋白的檢測(cè):采用Western blotting方法檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同胃粘膜病變中Hp感染和Akt

8、-Mdm2-p53信號(hào)通路表達(dá)的關(guān)系
　　 (1)在CNAG、MA、DYS和GC各粘膜病變中分別行Hp陽(yáng)性者和Hp陰性者比較,pAkt在CNAG組的Hp陽(yáng)性者顯著高于Hp陰性者(P＜0.05);Akt在各粘膜病變中均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);Mdm2在Dys組Hp陽(yáng)性者顯著高于陰性者(P＜0.05);突變型p53在MA組Hp陽(yáng)性者顯著高于陰性者(P＜0.05);PCNA在Dys組Hp陽(yáng)性者顯著高于陰性者(P＜0.05);Ba

9、x在CNAG、MA組陽(yáng)性者顯著高于陰性者(P＜0.05),其余各組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (2)在Hp陽(yáng)性的CNAG、MA、DYS和GC各粘膜病變中,Akt、pAkt在各病變組的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。Mdm2、PCNA蛋白的表達(dá)在GC、Dys組顯著高于CNAG、MA組(P＜0.05),Bax蛋白的表達(dá)在MA組最高,顯著高于CNAG、Dys、GC組(P＜0.05)
　　 (3)在Hp陽(yáng)性的CNAG、

10、MA、Dys胃粘膜病變中,對(duì)pAkt、Mdm2、突變型p53、Bax和PCNA蛋白的表達(dá)行相關(guān)性分析,pAkt和Mdm2,Mdm2和PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 2、Hp培養(yǎng)濾液對(duì)GES-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 (1)形念學(xué)變化:Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞后48h內(nèi)電鏡和倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈現(xiàn)典型的空泡化、凋亡改變,且隨Hp培養(yǎng)濾液濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。
　　 (2)1

11、:4濃度Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞48h后行DNA電泳,結(jié)果DNA條帶呈凋亡特征性梯狀改變,而對(duì)照組無(wú)此改變。
　　 (3)MTT檢測(cè)Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞后的增殖活性:在3h、6h和12h時(shí)間點(diǎn),各濃度組的細(xì)胞存活率和照組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。作用24h,各濃度組的細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),但各濃度組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。作用48h,1:4、1:2濃度組的細(xì)胞存活率(74.7

12、+12.1％,62.2+12.6％)均顯著低于對(duì)照組(100.0+8.3％)(P＜0.05),且呈濃度依賴性。但對(duì)照組與1:8組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05);作用72h時(shí),1:8、1:4、1:2、1:1組的細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),且呈濃度依賴性,均有顯著性差異(P＜0.05)。行1:8濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞80天后,和平行傳代的對(duì)照組比較,細(xì)胞存活率顯著增加。(P＜0.05)
　　 (4)流式

13、細(xì)胞儀分析顯示:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞48h后,細(xì)胞周期主要阻滯在G0-G1期(98.73±1.12％vs45.37±4.89％),凋亡率顯著上升(26.93±5.34％vs1.65±0.44％)(P＜0.05)。
　　 (5)單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞3h后,和對(duì)照組比較,彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例無(wú)顯著性差異(P＞0.05);作用48h后,彗星尾部D

14、NA量顯著增加。(P＜0.05)。
　　 3、Akt-Mdm2-053信號(hào)通路在Hp培養(yǎng)濾液對(duì)GES-1細(xì)胞影響中的作用
　　 (1)Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞后p53、Mdm2、Bax mRNA的表達(dá):1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞48h,p53 mRNA無(wú)顯著變化(P＞0.05);Mdm2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);
　　 (2)Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞后

15、Akt-Mdm2-p53通路相關(guān)蛋白水平及活性的變化:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細(xì)胞不同時(shí)間后,Akt蛋白無(wú)明顯變化,pAkt在1h后上升,在3h達(dá)最高峰,在48h內(nèi)持續(xù)升高,Mdm2蛋白具有類(lèi)似變化趨勢(shì);p53蛋白12h內(nèi)無(wú)明顯變化,在24、48h上升:Bax蛋白在1h后上升,48h內(nèi)持續(xù)升高。
　　 (3)加入Akt抑制劑LY294002處理GES-1細(xì)胞后,用1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用細(xì)胞,與未加入抑制劑比較

16、,12h和24h的細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05)。在作用24h后pAkt、Mdm2蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05),而p53蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路參與了Hp感染相關(guān)的胃黏膜病變發(fā)生、發(fā)展,在Hp感染導(dǎo)致的CNAG、MA、Dys病變階段中起作用,而在胃癌病變階段中與Hp感染無(wú)明顯關(guān)系,提示Akt-Mdm2-p53信號(hào)通路主要在Hp致癌的早期階段起作用

17、。
　　 2、在短期作用下,Hp培養(yǎng)濾液可導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞凋亡,活力下降,DNA損傷,且呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系;在低濃度培養(yǎng)濾液長(zhǎng)期作用下,Hp能誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞增殖活性升高。
　　 3、Hp可同時(shí)激活凋亡和增殖信號(hào)通路。在早期,Hp通過(guò)激活A(yù)kt和誘導(dǎo)Mdm2的表達(dá)對(duì)抗Hp誘導(dǎo)的凋亡作用,使p53水平無(wú)明顯變化。但在細(xì)胞DNA損害加重時(shí),Hp激活p53通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡和使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。在Hp感染時(shí)阻斷Akt通路可使