基于腸肝灌流模型的戊已丸配伍機制的研究.pdf

1、1研究目的
　　 中醫(yī)理論博大精深,中藥復(fù)方是中藥臨床應(yīng)用的主要形式,復(fù)方中藥味之間的伍用關(guān)系是中醫(yī)理論的精髓所在。探尋復(fù)方的配伍機理是中藥復(fù)方研究工作的重中之重。本研究以戊己丸作為工具藥,采用正交試驗設(shè)計的方法,借助腸肝灌流模型,從吸收、代謝、膽汁排泄的角度考察戊己丸不同配伍中代表成分小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、芍藥苷在腸肝灌流液和膽汁中的動態(tài)變化,借以分析戊己丸組成藥物對方劑的貢獻(xiàn)度和貢獻(xiàn)形式,探討其配伍機理；考察

2、戊己丸不同配伍腸肝灌流液對離體腸管、結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的影響。綜合藥動學(xué)、藥效學(xué)實驗結(jié)果,探索建立PK—PD模型,為中藥方劑配伍機理研究提供借鑒。
　　 2研究方法和結(jié)果
　　 2.1腸肝灌流模型的優(yōu)化Ⅰ
　　 方法:通過考察不同配方的灌流液(共8組)對各組的pH、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性,肝、腸干濕重比的影響,分析灌流液組成成分對肝功能、肝細(xì)胞損傷以及組織水腫程度的影響。
　　 結(jié)果:

3、第8組灌流液(不加紅細(xì)胞、地塞米松、去甲。腎上腺素)的pH,LDH,ALT與第1組灌流液(加紅細(xì)胞、地塞米松、去甲腎上腺素)相比無顯著性差異;第8組灌流液腸干濕重比與正常對照組相比無顯著性差異。
　　 結(jié)論:紅細(xì)胞、地塞米松、去甲腎上腺素對于維持腸肝灌流模型功能無顯著影響。
　　 2.2腸肝灌流模型的優(yōu)化Ⅱ
　　 方法:通過考察不同配方的灌流液(共4組)對各組的灌流液回收率、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AL

4、T)活性,以及肝、腸干濕重比的影響,比較不同灌流液的緩沖能力以及其對模型功能狀態(tài)的影響。
　　 結(jié)果:與第1組(K—H緩沖液,1％BSA)相比,第2組(K—R緩沖液,1％BSA)的灌流液回收率顯著升高(P<0.01)；LDH、ALT活性顯著降低(P<0.05,P<0.01)；與正常對照組相比,各組肝臟干濕重比顯著降低(P<0.01),腸道干濕重比無顯著性差異。
　　 結(jié)論:將K-H緩沖液換成K—R緩沖液理由充分,可以運用

5、到下一步實驗當(dāng)中。
　　 2.3戊己丸大鼠原位循環(huán)腸肝灌流液PK的研究
　　 方法:采用L9(34)正交設(shè)計表,將戊己丸組方中的黃連、吳茱萸、白芍作為3因素,各因素的3個不同劑量作為3水平,借助循環(huán)腸肝灌流模型,考察戊己丸不同配伍方及其相應(yīng)劑量的單味藥對代表成分吸收分?jǐn)?shù),吸收速率常數(shù)的影響。應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)、正交設(shè)計的極差分析、方差分析對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:對于提高戊己丸中小檗堿、

6、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、芍藥苷吸收分?jǐn)?shù)的最優(yōu)配伍比例分別是黃連:制吳茱萸:炒白芍=3:1:3、3:1:3、3:1:6、3:1:3、3:1:6。對于加速戊己丸中小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、芍藥苷吸收的最優(yōu)配伍比例是黃連:制吳茱萸:炒白芍=3:1:3、3:1:3、3:1:12、3:1:6、3:1:6。
　　 2.4戊己丸大鼠原位循環(huán)腸肝灌流液PD的研究
　　 方法:制備豚鼠離體腸管,考察不同配伍、不同時間點的

7、戊己丸循環(huán)腸肝灌流液對乙酰膽堿所致的離體腸管收縮的影響。采用DAS3.0軟件對藥理效應(yīng)進(jìn)行評價。
　　 結(jié)果:乙酰膽堿顯著收縮腸管,表現(xiàn)為張力顯著增加(P<0.01)。與空白對照組相比,1、2、4-8組均有顯著的抗乙酰膽堿作用(P<0.05,P<0.01)。DAS3.0軟件分析結(jié)果顯示貢獻(xiàn)度大小排序為黃連>白芍>吳茱萸,其中黃連有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),確定了黃連在戊己丸中君藥的地位。
　　 2.5戊己丸大鼠原位單次

8、腸肝灌流液PK的研究
　　 方法:采用L9(34)正交設(shè)計表,將戊己丸組方中的黃連、吳茱萸、白芍作為3因素,各因素的3個不同劑量作為3水平,借助循環(huán)腸肝灌流模型,考察戊己丸不同配伍方及其相應(yīng)劑量的單味藥對代表成分的吸收分?jǐn)?shù),門靜脈吸收藥-時曲線下面積(AUC),肝臟攝取率、肝臟攝取率。通過單因素方差分析(ANOVA)、正交設(shè)計的極差分析、方差分析對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:在單次灌流模型中,有助于提高小檗堿吸收

9、量、肝臟攝取率的最優(yōu)配伍比例分別為為黃連:制吳茱萸:炒白芍=12:1:12,3:6:3:有助于提高巴馬汀吸收量、肝臟攝取率的最優(yōu)配伍比例分別為為黃連:制吳茱萸:炒白芍=6:1:12,3:2:3;有助于提高吳茱萸堿吸收量、肝臟攝取率的最優(yōu)配伍比例分別為黃連:制吳茱萸:炒白芍=12:6:6,12:1:12;有助于提高吳茱萸次堿吸收量、肝臟攝取率的最優(yōu)配伍比例分別為黃連:制吳茱萸:炒白芍=12:6:6,6:6:12；有助于提高芍藥苷吸收量、肝

10、臟攝取率的最優(yōu)配伍比例分別為為黃連:制吳茱萸:炒白芍=6:2:12,3:2:6。
　　 2.6戊己丸大鼠原位單次腸肝灌流液PD的研究
　　 方法:制備急性分離的離體結(jié)腸平滑肌細(xì)胞,考察不同配伍、不同時間點的戊己丸單次腸肝灌流液對乙酰膽堿所致的離體結(jié)腸平滑肌細(xì)胞收縮的影響。采用DAS3.0軟件對藥理效應(yīng)進(jìn)行評價。
　　 結(jié)果:乙酰膽堿顯著收縮細(xì)胞長度,細(xì)胞收縮率達(dá)到22.87％,有顯著性差異(P<0.01)。與模型

11、對照組相比,經(jīng)90min灌流液預(yù)處理后,黃連高劑量組,1號方、3號方、4號方、7號方組的細(xì)胞長度明顯增加(P<0.05),黃連低劑量組、黃連中劑量組,5號方組的細(xì)胞長度明顯增加(P<0.01)；120min灌流液預(yù)處理后,黃連低劑量、5號方、7號方的細(xì)胞長度明顯增加(P<0.05)。DAS3.0軟件分析結(jié)果顯示貢獻(xiàn)度大小排序為黃連>白芍>吳茱萸,其中黃連有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),說明黃連在戊己丸中是治療腸痙攣類疾病的主要藥物(應(yīng)為君

12、藥)。
　　 2.7戊己丸單次腸肝灌流液PK-PD聯(lián)合模型
　　 方法:應(yīng)用Winonlin6.1軟件對戊己丸單次灌流液的濃度和藥效進(jìn)行擬合
　　 結(jié)果:戊己丸的PK-PD模型是一種抑制模型,即濃度越高,收縮率越低,這與實驗結(jié)果一致。得到PK—PD方程E=Emax×(1-(Ce／(Ce+EC50)))。其中1、2、3、6、9號方的擬合曲線與實測曲線吻合度較好。
　　 2.8戊己丸大鼠膽汁排泄的研究

13、　　 方法:考察不同配伍對戊己丸代表成分膽汁排泄率和膽汁排泄藥一時曲線下面積(AUG)的影響。通過單因素方差分析(ANOVA)、正交設(shè)計的極差分析、方差分析對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:促進(jìn)小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿膽汁排泄的最優(yōu)配伍分別是黃連:吳茱萸:白芍=12:1:6,12:1:6,3:6:3,6:6:3。配伍方的膽汁排泄均顯著低于同劑量單味藥(P<0.01)。
　　 3結(jié)論
　　 本實驗

14、利用腸肝灌流模型,研究戊己丸不同配伍和單味藥對代表成份吸收、代謝、排泄的影響。主要表現(xiàn)為吳茱萸限制黃連代表成分的吸收,促進(jìn)其肝臟攝取,抑制其膽汁排泄；白芍促進(jìn)黃連代表成分的吸收,抑制其肝臟攝取,促進(jìn)其膽汁排泄；黃連、白芍均促進(jìn)吳茱萸代表成分的肝臟攝取,抑制其膽汁排泄；黃連抑制白芍代表成分的肝臟攝取,促進(jìn)其膽汁排泄。并得出促進(jìn)吸收、代謝、排泄的最優(yōu)配方。藥理實驗結(jié)果顯示戊己丸對于乙酰膽堿所致的離體腸管收縮,結(jié)腸平滑肌細(xì)胞收縮有拮抗作用。統(tǒng)