TIM-3對人氣道上皮細胞株16HBE的NF-κB及炎癥相關因子表達水平調(diào)控的研究.pdf

1、變應性哮喘是一種常見的與免疫相關的復雜呼吸道炎癥性疾病，其特征主要是氣道反應性增高和針對環(huán)境過敏原的特異性IgE 或總IgE 升高，一般受遺傳、環(huán)境、個體免疫狀態(tài)等多重因素的影響而發(fā)病。據(jù)報道人類的Tim-3是Tims基因家族重要的成員之一，它就位于與哮喘呈高度連鎖的染色體5q31-33 區(qū)域。目前已有不少研究將Tim-3基因作為哮喘重要的易感候選基因，進行Tim-3基因多態(tài)性與哮喘的關聯(lián)研究。在部分人群中開展研究的結(jié)果顯示，Tim-3

2、基因多態(tài)性與哮喘有一定的相關性。
　　 近來的研究表明人體在正常情況下，Th1細胞和TH2細胞這兩類亞型受不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，分泌不同的細胞因子，并相互協(xié)調(diào)和拮抗，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。TH1/TH2細胞及其分泌的細胞因子的失衡是哮喘發(fā)病的影響因素。哮喘發(fā)病時，出現(xiàn)了TH2細胞的極化偏移，TH2細胞及其分泌的細胞因子相對增加。Tim-3 最初被發(fā)現(xiàn)在Th1細胞對抗原產(chǎn)生增殖性反應后表達于終末分化的TH1細胞上，并與Tim-3的配體g

3、alectin-9 結(jié)合后發(fā)揮終止Th1介導的免疫反應的功能。Tim-3與其配體galectin-9的結(jié)合，引發(fā)了一種抑制信號，導致了Th1細胞的凋亡，負調(diào)了Th1型免疫反應。但是，Tim-3的表達并不局限于T細胞。近來的研究通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應證實了Tim-3在多種人的正常和惡性上皮組織，小神經(jīng)膠質(zhì)細胞，單核細胞，樹突狀細胞，M2 巨噬細胞，肥大細胞和多種T細胞上均有表達，提示Tim-3 可能與人體的多個組織器官以及免疫系統(tǒng)的功

4、能相關。那么Tim-3是否在呼吸系統(tǒng)有所表達，它是否通過呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)而與哮喘相關聯(lián)正是需要進一步研究的問題。
　　 本研究我們首先在人呼吸道相關細胞株上篩選了Tim-3的表達，并建立hTim-3 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染16HBE的細胞株，應用屋塵螨和地塞米松處理上調(diào)hTim-3和未上調(diào)hTim-3的16HBE細胞株，檢測各處理組NF-Κb和炎癥相關因子表達水平，分析hTim-3對16HBE細胞株NF-Κb和炎癥相關因子表達水平的影響

5、。
　　
　　 第一部分 Pegfp-C2-hTim-3 真核表達載體的構建和hTim-3 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染16HBE細胞株的建立
　　 目的：篩選Tim-3表達陽性的人呼吸道相關細胞株，為進一步闡明Tim-3 可能與人呼吸道疾病相關奠定基礎；構建Pegfp-C2-hTim-3 真核表達載體，可供后續(xù)進一步研究hTim-3的功能使用。將測序完全正確的重組質(zhì)粒Pegfp-C2-hTim-3轉(zhuǎn)染入人支氣管上皮細胞株16H

6、BE中，篩選出陽性細胞克隆，為后續(xù)實驗提供一個平臺。
　　 方法：用含10％胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基于37℃5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中體外培養(yǎng)人呼吸道相關細胞株16HBE，A549，GLC-82，調(diào)整細胞到最佳狀態(tài)，對數(shù)生長期時收集細胞，抽提總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為Cdna。參照人GenBank中Tim-3基因的全長序列，使用Primer5.0設計并合成其引物，采用PCR 檢測以上三種細胞Tim-3的Mrna表達。將健康人外周

7、血Tim-3基因全長Cdna 片段克隆入真核表達載體Pegfp-C2，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定，構建包含目的基因Tim-3的重組質(zhì)粒Pegfp-C2-hTim-3。利用脂質(zhì)體介導Pegfp-C2-hTim-3質(zhì)粒和Pegfp-C2 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染16HBE細胞，熒光顯微鏡觀察16HBE細胞的瞬時轉(zhuǎn)染效率，并采用含G418的培養(yǎng)基篩選以獲得整合了Pegfp-C2-hTim-3和Pegfp-C2的陽性細胞克隆，用熒光顯微鏡觀察Pegfp

8、-C2-hTim-3和Pegfp-C2在16HBE細胞上的定位表達，用Real-time PCR 技術和Western Blot技術檢測轉(zhuǎn)染Pegfp-C2-hTim-3和轉(zhuǎn)染Pegfp-C2的16HBE細胞上hTim-3的表達情況。
　　 結(jié)果：1.PCR 結(jié)果顯示人呼吸道相關細胞株16HBE，A549，GLC-82 均表達Tim-3Mrna。2.構建成具有篩選特征和能夠穩(wěn)定表達的Pegfp-C2-hTim-3 質(zhì)粒載體，測序

9、結(jié)果與預期設計完全一致。3. 瞬時轉(zhuǎn)染后經(jīng)熒光顯微鏡檢查可見陽性表達Pegfp-C2-hTim-3 綠色熒光蛋白的16HBE細胞不足8％，而陽性表達Pegfp-C2綠色熒光蛋白的16HBE細胞不足15％。采用G418 篩選后獲得陽性表達野生型hTim-3和外源性Pegfp-C2-hTim-3的16HBE細胞表達的hTim3水平比轉(zhuǎn)染Pegfp-C2 空質(zhì)粒的16HBE細胞顯著增高(p＜0.01)，經(jīng)熒光顯微鏡觀察前者定位在胞膜上，而后者

10、則定位在胞質(zhì)上。
　　 結(jié)論：人呼吸道相關細胞株16HBE，A549，GLC-82均表達 Tim-3 Mrna，Tim-3可能與人類呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展相關。成功構建了真核表達載體Pegfp-C2-hTim-3。成功篩選獲得了高表達Pegfp-C2-hTim-3的16HBE 陽性克隆細胞，可供后續(xù)研究使用。
　　
　　 第二部分 hTim-3對經(jīng)屋塵螨或/和地塞米松處理的16HBE細胞株NF-Κb表達影響的探討

11、
　　 目的：研究T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白3（簡稱TIM-3）對人氣道上皮細胞株16HBE 經(jīng)屋塵螨或/和地塞米松處理后NF-Κb及相關細胞因子表達的調(diào)控，并探討相應機制。
　　 方法：實驗分兩組，分別為轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2和轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2-hTim-3的16HBE細胞株。兩組細胞株分別用一定濃度的屋塵螨或/和地塞米松處理。提取細胞Mrna, 并逆轉(zhuǎn)錄為 Cdna, 實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后的不同

12、處理組細胞株Tim-3, NF-Κb, IFN-γ, galectin-9, T-bet, IL-4和 GATA-3等的Mrna表達水平。提取細胞蛋白后，Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后的不同處理組細胞株NF-Κb的蛋白表達水平。分析 hTim-3對經(jīng)屋塵螨或/和地塞米松處理的16HBE細胞株NF-Κb及相關細胞因子表達的調(diào)控，并探討相應的機制。
　　 結(jié)果：1.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，當16HBE細胞用屋塵螨或/和地

13、塞米松處理時，轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2-hTim3質(zhì)粒的16HBE細胞株上Tim-3(p＜0.01), NF-Κb(p＜0.01), IFN-γ(p＜0.01), T-bet(p＜0.01)， galectin-9(p＜0.01), IL-4(p＜0.01)的表達與相應處理的轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2質(zhì)粒的16HBE細胞的以上指標表達有顯著性差異，而GATA-3并沒有明顯的改變(p＞0.05)。而且，在轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2-hTim3質(zhì)粒的

14、16HBE細胞株中，Tim-3的表達與IFN-γ, T-bet和 galectin-9的表達呈正相關，而與NF-Κb和 IL-4的表達呈負相關；但是，在轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2質(zhì)粒的16HBE細胞中，并未存在這種較強的相關性。而且，當用一定濃度的屋塵螨或/和地塞米松處理轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2-hTim3質(zhì)粒的16HBE細胞時，Tim-3對NF-Κb表達的影響可能通過上調(diào) IFN-γ， T-bet，galectin-9和下調(diào) IL-4的表達

15、實現(xiàn)。2. Western Blot結(jié)果顯示，當用屋塵螨或/和地塞米松處理16HBE細胞時，轉(zhuǎn)染了Pegfp-C2-hTim3質(zhì)粒的16HBE細胞中Tim-3的表達與NF-Κb的蛋白表達呈負相關；但是，在轉(zhuǎn)染Pegfp-C2的16HBE細胞中未出現(xiàn)這種明顯的趨勢。這表明轉(zhuǎn)染Pegfp-C2-hTim3質(zhì)粒的16HBE細胞中Tim-3的上調(diào)抑制了NF-Κb的蛋白表達。
　　 結(jié)論：在16HBE細胞中，Tim-3的上調(diào)可能通過上調(diào)I