妊娠期糖尿病患者外周血白細(xì)胞NF-κB的表達(dá)及血清炎癥因子水平的研究.pdf

1、本研究包括以下兩部分： 第一章妊娠期糖尿病患者血清IL-6、hs-CRP水平與胰島素抵抗的關(guān)系研究 【研究目的】 了解妊娠期糖尿病患者IL-6、hs-CRP的血清水平，初步探討上述炎癥因子水平與胰島素抵抗、胰島細(xì)胞功能之間的關(guān)系，進(jìn)而初步探討GDM發(fā)病與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。 【研究方法】 1、選取2006年2月至2006年12月在我院產(chǎn)科門診進(jìn)行孕期健康檢查的非糖尿病妊娠中晚期(24-36 孕周)孕婦

2、進(jìn)行篩查。另選取孕齡期健康志愿女性作為正常對照組(control)組。兩組孕婦均于24孕周后常規(guī)進(jìn)行50g葡萄糖篩查試驗(yàn)，1h測血糖，陰性者(血糖值<7.8mmol/L)納入妊娠正常糖耐量(gestational normalglucose tolerance，NGT)組。若血糖≥7.8mmol/L，于3日后做100g OGTT試驗(yàn)，診斷根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(America Diabetes Mellitus，ADA)2000年頒布的GD

3、MC&C診斷標(biāo)準(zhǔn)(Carpenter-Coustan Critia)，即空腹、服糖后1、2、3小時4個時點(diǎn)結(jié)果分別為5.3、10.0、8.6和7.8mmol/L，受試者兩項(xiàng)或兩項(xiàng)以上結(jié)果達(dá)到或超過診斷標(biāo)準(zhǔn)即診斷為GDM，納入妊娠期糖尿病(gestational diabetesmellitus，GDM)組；一項(xiàng)結(jié)果達(dá)到或超過診斷標(biāo)準(zhǔn)為糖耐量低減(impairedglucose tolerance，IGT)，不在本研究范圍內(nèi)；四項(xiàng)全部正常

4、者，納入NGT組。篩查時詳細(xì)詢問并記錄年齡、孕前體重，測量腹圍、身高、體重，計(jì)算體重指數(shù)(body mass index，BMI)(孕前BMI和篩查時BMI)。2、各組研究對象禁食8～14h后次晨抽取空腹靜脈血，留取血清，置-20℃保存待測IL-6和hs-CRP。同時留取血樣立即測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，血糖采用葡萄糖氧化酶法，胰島素采用酶

5、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法。 3、放射免疫測定法(radioimmunoassay，RIA)測三組空腹血清IL-6濃度，免疫散射比濁法測三組血清hs-CRP濃度。利用Haffner等提出的穩(wěn)態(tài)模型評估法(homeostasis model assessment，HOMA)評價胰島素抵抗性和胰島β細(xì)胞功能。穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis mod

6、el assessment-Insulin resistance，HOMA-IR)=FINS*FBG/22.5，胰島素分泌指數(shù)(homeostasis model assessment-B，HOMA-B)=20*FINS/FBG-3.5。 4、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)處理前進(jìn)行相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。三組資料比較用多樣本均數(shù)比較的單向方差分析(One-way A

7、NOVA)，若方查分析顯著，采用LSD法和SNK法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩樣本均數(shù)比較；應(yīng)用雙變量相關(guān)分析(Bivariate)分析兩變量間相關(guān)性。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。 【研究結(jié)果】 1、一般臨床資料比較三組對象年齡、身高、孕前體重、孕前BMI均無顯著性差異(P>0.05)。兩組孕婦孕周、腹圍、孕中晚期體重亦無明顯差異(P>0.05)，GDM組孕婦腹圍、BMI顯著高于NGT組(P<0.05)。 2、胰島素抵抗和胰島素分

8、泌比較GDM組FBG顯著高于NGT組和對照組(P<0.01)，但NGT組與對照組無明顯差異(P>0.05)；GDM組FINS顯著高于NGT組和對照組(P<0.01)，NGT組顯著高于對照組(P<0.01)；GDM組HOMA-IR顯著高于NOT組和對照組(P<0.01)，NGT組亦高于對照組(P<0.05)；GDM組HOMA-B顯著低于NGT組和對照組(P<0.01)，NGT組亦明顯低于對照組(P<0.05)。 3、炎癥因子水平比

9、較 GDM組、NOT組、對照組血清IL-6水平分別為(112.63±15.38)ng/ml、(65.08±9.99)ng/ml、(61.48±10.09)ng/ml，呈逐漸降低趨勢，GDM組與NGT組、對照組均具顯著性差異(P<0.01)，但NGT組與對照組無明顯差異(P>0.05)；GDM組、NGT組、對照組血清hs-CRP水平分別為(5.28±1.74)mg/L、(1.63±0.72)mg/L、(1.54±0.8)mg/L，呈逐漸降

10、低趨勢，GDM組與NGT組、對照組均具顯著性差異(P<0.01)，但NGT組與對照組無明顯差異(P>0.05)。 4、相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示GDM組中IL-6、hs-CRP與孕期腹圍、體重、BMI均無明顯相關(guān)(P>0.05)。IL-6水平與FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-B顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.384、0.463、0.485、-0.358(均P<0.01)；hs-CRP水平與FBG、FINS、HO

11、MA-IR、HOMA-B顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.330、0.400、0.413、-0.340(均P<0.01)；IL-6與hs-CRP顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.814(P<0.01)。 【研究結(jié)論】 1、妊娠中晚期NGT組、GDM組孕婦胰島素抵抗較正常孕齡婦女逐漸加重，同時胰島素分泌能力逐漸下降。 2、GDM孕婦IL-6、hs-CRP 血清水平明顯升高，且與HOMA-IR、HOMA-B顯著相關(guān)，故炎癥因子IL-

12、6、CRP可能通過多種機(jī)制加重IR，參與GDM的發(fā)病。 第二章妊娠期糖尿病患者外周血白細(xì)胞NF-kB的表達(dá) 【研究目的】 了解妊娠期糖尿病患者NF-kB的表達(dá)水平，初步探討NF-kB表達(dá)水平以及上述炎癥因子水平與胰島素敏感性之間的關(guān)系，進(jìn)而探討GDM發(fā)病與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。 【研究方法】 采集三組實(shí)驗(yàn)對象外周抗凝血，分離白細(xì)胞，少量細(xì)胞涂片，行免疫熒光化學(xué)染色，剩余細(xì)胞提取核蛋白，行凝膠遷移電泳(e

13、lectrophoretic mobility shiftassay，EMSA)，對比各組NF-kB的表達(dá)水平。 1、分組 實(shí)驗(yàn)分組同第一部分，分別從GDM組、NGT組、對照組隨機(jī)各抽取10例，作為本部分實(shí)驗(yàn)各組。 2、外周血白細(xì)胞分離肘靜脈采取實(shí)驗(yàn)對象空腹抗凝血5mL，加5-10倍體積的紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，洗滌后離心，獲得白細(xì)胞。 3、核蛋白的提取將白細(xì)胞懸液離心后去上清夜，按文獻(xiàn)步驟操作，先裂解胞

14、膜，去胞質(zhì)蛋白，再裂解核膜，收集上清液即為核蛋白提取物。 4、各組NF-kB表達(dá)水平檢測4.1免疫熒光化學(xué)染色法將白細(xì)胞懸液涂于0.1％多聚賴氨酸載玻片上，免疫熒光化學(xué)染色后，在共聚焦顯微鏡下攝像并觀察NF-kB在胞漿和胞核內(nèi)的分布情況。 4.2凝膠遷移電泳(EMSA)法將分離的白細(xì)胞提取胞核蛋白。凝膠遷移電泳(EMSA)后觀察胞核蛋白NF-kB遷移及與DNA結(jié)合情況，凝較成像分析系統(tǒng)攝像、分析結(jié)果。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。三組資料比較用多樣本均數(shù)比較的單方差分析One-way ANOVA，若方差分析顯著，采用LSD法和SNK法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩樣本均數(shù)比較。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。 【研究結(jié)果】 GDM組外周血白細(xì)胞核內(nèi)存在NF-kB激活。 1、免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示對照組細(xì)胞漿染色陽性，細(xì)胞核染色陰性，NGT組胞核內(nèi)輕度陽性染色，GDM組胞

16、核內(nèi)顯著陽性染色，說明GDM組NF-kB由細(xì)胞漿向細(xì)胞核移位，NF-kB被激活。 2、EMSA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GDM組NF-kB被激活，對照組及NGT組有較低水平的NF-kB表達(dá)，其灰度相對百分比分別為5.71％、8.66％，但兩組間無顯著性差異(P>0.05)，而GDM組可見明顯的NF-kB表達(dá)，其灰度相對百分比分別為28.32％，與對照組相比較，幾乎高出5倍(P<0.001)。 【研究結(jié)論】 1、GDM組白細(xì)