人氣道上皮細(xì)胞抗菌肽hBD-2誘導(dǎo)表達(dá)的信號途徑及影響.pdf

1、內(nèi)源性抗菌肽(Endogenousantibioticpeptides)是動、植物天然免疫的重要介質(zhì)，在哺乳動物(包括人)中，由于對革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌、螺旋體、分枝桿菌及某些包膜病毒等有很強(qiáng)殺傷活性，故將其命名為防御素(defensin)。迄今為止，在人體中已發(fā)現(xiàn)的防御素共有三類(α、β、θ)。其中β防御素家族共發(fā)現(xiàn)28種。研究表明人β防御素-2(Humanβ-defensin-2，hBD-2)是粘膜和上皮細(xì)胞抵抗微生物入侵的重

2、要介質(zhì)，在持續(xù)暴露在病原微生物的器官(皮膚、臟器等)粘膜表面發(fā)揮重要的抗菌作用，是第一個發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽，它不僅具有廣譜抗微生物活性，而且在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用，起著連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁作用。因此hBD-2在治療肺部感染性疾病、皮膚病中具有廣泛的應(yīng)用前景。臨床治療呼吸道感染性疾病工作中，細(xì)菌對傳統(tǒng)的抗生素的耐藥己成為當(dāng)今治療呼吸道感染疾病面臨的難題，應(yīng)當(dāng)從新的角度研發(fā)抗感染藥物，作為內(nèi)源性抗菌肽的代

3、表hBD-2是當(dāng)今研究的焦點。但hBD-2作為一種新型抗菌物質(zhì)使用于臨床進(jìn)行開發(fā)，目前遇到很大困難，例如：人工合成造價極其昂貴；通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)也面臨許多難題等。因此，本實驗通過選用肺炎鏈球菌、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)及TNF-α刺激人原代支氣管上皮細(xì)胞(humanbronchialepithelialcells，HBECs)，檢測hBD-2表達(dá)；凝膠遷移率法(EMSA)及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測hBD

4、-2表達(dá)時NF-кB活性、類型及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]in)的變化；以及用不同的鈣調(diào)節(jié)劑(EGTA、BAPTA-AM、肝素及ATP)與TNF-α聯(lián)合作用于細(xì)胞，對hBD-2mRNA表達(dá)、NF-кB活性及[Ca2+]in的影響，旨在闡明人氣道上皮細(xì)胞hBD-2表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及影響因素，探討hBD-2可誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制，為通過人工誘導(dǎo)方法增強(qiáng)內(nèi)源性hBD-2表達(dá)發(fā)揮其藥理抗菌活性治療呼吸道感染及解決細(xì)菌耐藥問題提供實驗依據(jù)。

5、 方法 1.采用人肺葉或肺段支氣管，用蛋白酶ⅩⅣ消化加機(jī)械刮刷法分離上皮細(xì)胞，用添加必需營養(yǎng)因子的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，體外原代培養(yǎng)HBECs，并用細(xì)胞角蛋白作免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定培養(yǎng)的HBECs。 2.RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblotting法檢測肺炎鏈球菌、TNF-α及LPS刺激培養(yǎng)HBECs的hBD-2表達(dá)。 3.EMSA檢測TNF-α誘導(dǎo)HBECshBD-2表達(dá)時NF-кB活性及亞型

6、變化；RT-PCR檢測NF-кB抑制劑PDTC對TNF-α誘導(dǎo)HBECshBD-2mRNA表達(dá)的影響。 4.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測TNF-α刺激人HBECs時[Ca2+]in變化情況；用細(xì)胞內(nèi)鈣鰲合劑(BAPTA-AM)、細(xì)胞外鈣鰲合劑(EGTA)及IP3受體拮抗劑(肝素)與TNF-α聯(lián)合作用于細(xì)胞，RT-PCR檢測hBD-2mRNA表達(dá)；EMSA檢測NF-кB活性的變化；激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測[Ca2+]in變化。

7、 5.用鈣非特異性調(diào)節(jié)劑ATP作用于HBECs，檢測[Ca2+]in、NF-KB活性及hBD-2mRNA表達(dá)變化情況。 結(jié)果 1.以人肺葉或肺段支氣管為取材對象，用添加營養(yǎng)因子的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基成功培養(yǎng)了HBECs。 2.不同質(zhì)量濃度的肺炎鏈球菌(0.001cfu/ml、0.01cfu/ml、0.1cfu/ml、1cfu/ml、10×107cfu/ml)、TNF-α(1ng/ml、10ng/m

8、l、100ng/ml、1000ng/ml)及LPS(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L)刺激HBECs3h后，hBD-2mRNA表達(dá)呈劑量依賴性升高，與對照組差異顯著(p＜0.01、0.01、0.01)。 3.一定濃度的肺炎鏈球菌(0.1×107cfu/ml)、TNF-α(10ng/ml)及LPS(0.1mg/L)刺激培養(yǎng)的HBECs，(1)1.5-3h后可見hBD-2mRNA表達(dá)，并持續(xù)24h；(2)2

9、-4h后免疫細(xì)胞化學(xué)證實HBECs胞漿hBD-2蛋白表達(dá)；(3)2-4h后免疫印跡證實HBECs裂解液中含有hBD-2蛋白。 4.P65/P50型NF-кB異二聚體激活參與了TNF-α誘導(dǎo)HBECs的hBD-2表達(dá)，TNF-α在一定濃度范圍內(nèi)(0.1ng/ml-1000ng/ml)與NF-кB活性增高呈劑量依賴性關(guān)系；NF-кB抑制劑PDTC可抑制TNF-α誘導(dǎo)HBECs的hBD-2mRNA表達(dá)。 5.一定濃度的TNF-

10、α(10ng/ml)刺激HBECs可使[Ca2+]in增高；細(xì)胞外鈣鰲合劑(EGTA)不能抑制TNF-α誘導(dǎo)的[Ca2+]in增高，對NF-кB活性增高及hBD-2mRNA表達(dá)增高無影響(p＞0.05、0.05)；細(xì)胞內(nèi)鈣鰲合劑(BAPTA-AM)及IP3受體拮抗劑(肝素)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-кB活性及hBD-2mRNA表達(dá)(p＜0.01、0.01；p＜0.01、0.01)。 6.ATP在一定濃度范圍內(nèi)(40-100μM

11、)可使HBECs內(nèi)鈣離子濃度短暫性增高；一定濃度ATP(100μM)刺激HBECs3h后NF-кB活性增高，刺激6h后可見hBD-2mRNA表達(dá)(p＜0.01)，但在時間上明顯滯后于TNF-α所致的NF-кB活化增高及hBD-2mRNA表達(dá)。 結(jié)論 1.本實驗成功培養(yǎng)了HBECs。 2.本實驗證實了肺炎鏈球菌、TNF-α及LPS作用人HBECs可誘導(dǎo)hBD-2表達(dá)，hBD-2的表達(dá)及分泌可能是氣道最初防御反應(yīng)，與

12、細(xì)胞因子組成網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，發(fā)揮防御病原微生物及免疫作用。 3.P65/P50型NF-кB異二聚體激活參與了TNF-α誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞hBD-2的表達(dá)；NF-кB是HBECs表達(dá)hBD-2必需的核轉(zhuǎn)錄因子。 4.TNF-α誘導(dǎo)HBECs表達(dá)hBD-2是通過[Ca2+]in增高致NF-кB激活實現(xiàn)的；胞內(nèi)鈣離子濃度增高機(jī)制是激活細(xì)胞內(nèi)IP3受體敏感性鈣通道使鈣庫中鈣離子釋放至胞漿所致。 5.鈣非特異性調(diào)節(jié)劑ATP可誘導(dǎo)

13、HBECsNF-кB活化及hBD-2mRNA表達(dá)，但時間較TNF-α誘導(dǎo)NF-кB活化、hBD-2mRNA表達(dá)滯后。 綜上述，一定濃度的肺炎鏈球菌、TNF-α及LPS可誘導(dǎo)HBECs表達(dá)hBD-2；鈣非特異性調(diào)節(jié)劑ATP也可誘導(dǎo)HBECs表達(dá)hBD-2mRNA，但具有滯后性；細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高致NF-кB信號通路激活介導(dǎo)了TNF-α誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞hBD-2基因的轉(zhuǎn)錄。上述實驗為臨床實際工作中通過人工誘導(dǎo)方法增強(qiáng)內(nèi)源性hBD-2