滲透壓對人氣道上皮細胞黏蛋白5AC分泌的調(diào)控研究.pdf

1、目的:
　　 氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥性疾病包括慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺囊性纖維化等疾病的一個重要病理特征。人支氣管上皮細胞黏液增多是炎癥級聯(lián)反應的結(jié)果,水、無機鹽離子和黏蛋白(mucin,MUC)等大分子構成氣道黏液層,黏液潴留可導致病變氣道阻塞加重,并為氣道定植細菌提供良好的培養(yǎng)基,同時可釋放多種促分泌因子加劇黏液潴留過程[1,2,3],從而加快疾病的進程并使病情惡化。理論上黏液層物理和化學性質(zhì)的任何改變都會影響

2、黏液性狀和分泌量,己知MUC5AC是氣道主要分泌型MUC,是超負荷生成病理性黏液中的主要成分,作為炎癥氣道黏蛋白的主要特征性表型,決定著高分泌黏液的病理特征[4,5]。目前對MUC5AC基因表達和分泌的相關分子機制已廣泛開展,已知體內(nèi)多種炎癥介質(zhì)和細胞外因素如白介素(interleukin,IL)-4[6]、IL-13[7]、IL-9[8]、IL-6[9]、IL-1β、腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF-α)

3、[10]、中性粒細胞彈力酶(neutrophil elastase,NE)[11]、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,.EGFR.)配體[12]、空氣污染物[13]、細菌產(chǎn)物[14]、類花生酸類、自由基[15]和氧化應激[16]等刺激均可以導致MUC5AC的異常,但是對臨床上常見的高滲鹽水可誘導排痰的分子機制卻并不清楚,滲透壓改變的條件下對MUC5AC分泌的效應尚無報道。既往研究發(fā)現(xiàn)氣道

4、上皮細胞黏液出胞過程中黏液分泌顆粒復合物形成必需熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)70參與[17],HSP70可在多種刺激下誘導表達以保護氣道細胞,并與蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)有關[18],滲透壓反應增強子結(jié)合蛋白(osmoticresponse element binding protein,OREBP/nuclear factor Of activated Tcells,NFA

5、T5/toncity-responsive binding-protein,TonEBP)是哺乳動物細胞內(nèi)唯一已知滲透壓相關轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控HSP70等的表達,保護細胞免受高滲應激[19]。本研究選用體外培養(yǎng)人支氣道上皮細胞株HBE16的方法,以常見的高滲鹽水作為干預因素,探討滲透壓刺激對MUC5AC分泌的效應,以及HSP70、PKC和OREBP在黏液分泌中的機制,研究高滲下OREBP對HSP70的調(diào)控作用及其對MLIC5AC分泌的影響

6、,從而深入闡明高滲在氣道慢性炎癥性疾病黏液分泌中的可能機制,并為能從基因和分子水平解釋有效的臨床防治措施提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 細胞培養(yǎng)和高滲處理:體外培養(yǎng)正常人氣道上皮HBE16細胞株,加入10％高滲氯化鈉配成不同濃度的高滲培養(yǎng)基,滲透壓計檢測滲透壓。高滲培養(yǎng)前用無激素和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。四甲基偶氮唑鹽光吸收法(methyl thiazolyl tetrazoliam,MTT法)檢測細胞活性。PKC各亞型抑

7、制劑和OREBP siRNA做為干擾因素處理高滲培養(yǎng)HBE16細胞。
　　 蛋白表達和轉(zhuǎn)錄水平的檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測培養(yǎng)上清中MUC5AC蛋白含量作為評價黏液分泌量的指標;Western Blot檢測HSP70-2和OREBP蛋白表達,RT-PCR方法半定量檢測HSP70-2轉(zhuǎn)錄水平。細胞免疫化學和激光共聚焦技術觀察細胞在高滲下HSP70-2

8、和OREBP蛋白表達的變化。
　　 HSP70-2基因上游不同長度啟動子序列熒光素酶(luciferase,Luc)報告基因質(zhì)粒載體的設計和構建:從HBE16細胞中抽提人基因組DNA序列為模板,根據(jù)HSP70-2基因啟動子上游調(diào)控區(qū)的基因序列及質(zhì)粒表達載體pGL3-Basic的結(jié)構特點及實驗需要設計擴增引物,PCR擴增HSP70-2基因啟動子上游5’端不同片斷,經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實HSP70-2基因啟動子上游序列系列截短的

9、熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒構建成功。
　　 含人HSP70-2基因啟動子滲透壓反應增強子(osmotic responseelement,ORE)位點定點突變序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體的設計和構建:基因啟動子軟件分析提示HSP70-2基因啟動子上游存在兩個潛在的ORE,ORE1位于轉(zhuǎn)錄起始點-1975位,ORE2位于-93位。ORE的共有序列為:TGGAANNNYNY(Y為T或C,N為任一堿基)。設計并導入定點突變引物使HSP7

10、0-2啟動子上游的兩個ORE位點分別單獨失活。含人HSP70-2基因上游ORE位點定點突變序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實構建成功。
　　 細胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性測定:報告基因質(zhì)粒和OREBP siRNA通過脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染HBE16細胞,連續(xù)培養(yǎng)24h和48h后加高滲處理,12小時孵育后收集細胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)計算報告基因的相對表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、高滲能有效

11、刺激HBE16細胞培養(yǎng)上清MUC5AC蛋白分泌量增加,與對照組相比較差異顯著,有統(tǒng)計學意義,且結(jié)果顯示在所選實驗濃度范內(nèi)(500和600mOsm/kgH2O)MUC5AC隨培養(yǎng)時間和培養(yǎng)濃度的改變對高滲鹽水刺激有時間和劑量依賴關系(p＜0.05)。當滲透濃度增加到1000mOsm/kgH2O時HBEl6細胞存活率降低,與對照組相比,差異有顯著性(p＜0.05)。
　　 2、高滲培養(yǎng)后,OREBP和HSP70-2蛋白在細胞內(nèi)的熒光

12、表達顯著增加,HSP70-2蛋白和轉(zhuǎn)錄水平較對照組顯著升高,并隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加(p＜0.05),同時OREBP蛋白表達增加,且隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增)加(p＜0.01)。
　　 3、用PKCμ抑制劑G(o)6976處理高滲培養(yǎng)下HBE16細胞,培養(yǎng)上清MUC5AC蛋白含量、HSP70-2蛋白和轉(zhuǎn)錄水平較高滲組顯著降低(p＜0.01),但仍高于對照組(p＜0.05);而PKCα抑制劑Safingol,PKCβ抑制劑LY

13、333531和PKCδ抑制劑Rottlerin處理細胞后,上述指標水平無顯著改變。
　　 4、siRNA抑制OREBP表達后,高滲刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相對含量顯著減少(p均＜0.05)。
　　 5、成功構建系列截短的HSP70-2啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒,真核細胞轉(zhuǎn)染技術與OREBP siRNA共轉(zhuǎn)染導入HBE16細胞,觀察高滲刺激下的細胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染分別含2、1、1個ORE位點的

14、pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/+165)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc細胞后在高滲刺激下的熒光素酶比活性無明顯改變(p＞0.05);而轉(zhuǎn)染HSP70-2啟動子不含ORE位點的pGL3-HSP70-2(-66/+165)-Luc細胞在高滲刺激下的熒光素酶比活性與高滲組的細胞相比顯著降低(p＜0.01)。
　　 6、構建突變-1975

15、位點的OREl和位于-93位點的ORE2的HSP70-2啟動子報告基因載體,與OREBP siRNA共轉(zhuǎn)染細胞后檢測,突變ORE1后細胞在高滲刺激下的熒光素酶表達與高滲組相比無顯著改變(p＞0.05);突變ORE2后高滲刺激下的熒光素酶比活性與高滲組比較顯著降低有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、高滲刺激可誘導體外培養(yǎng)的HBE16細胞MUC5AC分泌,在所選實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)時間和濃度依賴關系,但同時

16、高滲對HBE16細胞活力的影響也逐步加大,隨滲透時間延長和滲透濃度加大細胞存活率下降。
　　 2、高滲培養(yǎng)后,OREBP和HSP70-2蛋白在細胞內(nèi)的熒光表達顯著增加,HSP70-2蛋白和轉(zhuǎn)錄水平,OREBP蛋白水平均顯著增加,提示HSP70-2和OREBP參與高滲致HBE16細胞MUC5AC分泌過程。用PKCμ抑制劑處理高滲培養(yǎng)下細胞,HSP70-2蛋白、轉(zhuǎn)錄水平和MUC5AC分泌較高滲組顯著減少,但仍高于對照組;而用PKCα

17、抑制劑、PKCβ抑制劑和PKCδ抑制劑處理后HSP70-2蛋白、轉(zhuǎn)錄水平和MUC5AC分泌均無改變,考慮高滲致黏液分泌可能是部分通過PKCμ-HtSP70-2依賴的信號通路。siRNA抑制OREBP表達后,高滲刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相對含量顯著減少,進一步證實OREBP和HSP70-2參與高滲下黏液分泌的過程。
　　 3、成功構建系列截短的HSP70-2上游啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒和含兩個OR

18、E位點突變的HSP70-2啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒,為今后深入開展高滲對黏液分泌的調(diào)控機制奠定基礎。
　　 4、高滲刺激可分別誘導HSP70-2啟動子含2、1、1個ORE位點的pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/-H65)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc序列的報告基因質(zhì)粒仍然表達熒光素酶,而不含ORE位點的pGL3-HSP70-2(-6

19、6/-H65)-Luc序列的報告基因質(zhì)粒對高滲刺激無反應,不表達熒光素酶,說明在HSP70-2啟動子上游-66到-353序列之間存在ORE關鍵位點。
　　 5、高滲刺激可誘導HSP70-2啟動子-1975位點的ORE1發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒表達熒光素酶,而含有-93位點的ORE2發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒對高滲刺激無明顯反映,提示高滲鹽水誘導OREBP通過與HSP70-2啟動子上-93位點的ORE結(jié)合而激活HSP70