甲狀腺素對氣道黏蛋白5AC基因表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的： 觀察甲狀腺素對氣道上皮細(xì)胞黏蛋白(mucin，MUC)5AC表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制。 方法： 1、MUC5AC在A549細(xì)胞中的表達(dá)：體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，以不同濃度的甲狀腺素刺激A549細(xì)胞24h后，用ELISA法檢測上清液中MUC5AC蛋白含量，用RT-PCR法檢測細(xì)胞中MUC5ACmRNA水平。 2、設(shè)計(jì)、構(gòu)建MUC5AC基因5’上游序列的表達(dá)質(zhì)粒：根據(jù)MUC-5AC基因5’調(diào)控區(qū)的DNA序

2、列、表達(dá)載體pGL3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，以人基因組總DNA為模板擴(kuò)增MUC5AC基因5’非編碼區(qū)片段，雙酶切后插入pGL3質(zhì)粒構(gòu)成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功后，用脂質(zhì)體將表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入甲狀腺素(濃度為6.5ng/ml)處理，繼續(xù)孵育24h收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定報(bào)告基因的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、用ELISA法

3、檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白的表達(dá)顯示，甲狀腺素可成濃度、時(shí)間依賴性地使A549細(xì)胞MUC5AC蛋白表達(dá)水平下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用RT-PCR法檢測MUC5ACmRNA表達(dá)顯示，甲狀腺素處理組A549細(xì)胞MUC5AC mRNA相對表達(dá)量明顯低于對照組。 2、成功構(gòu)建了4種含有MUC5AC基因啟動(dòng)子序列的表達(dá)質(zhì)粒，分別導(dǎo)入A549細(xì)胞后予甲狀腺素刺激，觀察到甲狀腺素可抑制重組質(zhì)粒pGL3-MUC5A

4、C-1330/+48、pGL3-MUC5AC-1250/+48熒光素酶的表達(dá)，而不能抑制重組質(zhì)粒pGL3-MUC5AC.1200/+48、pGL3-MUC5AC-1020/+48熒光素酶的表達(dá)。 結(jié)論： 1、甲狀腺素可抑制A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成分泌，甲狀腺素在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制MUC5AC表達(dá)。 2、成功地構(gòu)建了四種含人MUC5AC基因啟動(dòng)子系列截短的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，為研究甲狀腺