EETs和滲透壓對大鼠內髓集合管細胞γ-ENaC調控機制的研究.pdf

1、流行病學調查及實驗研究表明，鹽作為重要的環(huán)境因素與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關。20世紀70年代末Kawasaki和Luft提出了“血壓的鹽敏感性(salt—sensitive)”概念，定義為：相對高鹽攝入所引起的血壓升高。鹽敏感性者細胞膜Na+轉運缺陷是其主要發(fā)生機制，高鹽攝入直接導致鈉潴留，引起血容量過負荷，從而導致血壓升高。水鈉潴留是引起高血壓的重要機制，一直深受國內外學者關注，從腎小管離子通道去探討高血壓的鹽敏感性發(fā)生機制近年來取得

2、了長足進展。 上皮鈉通道(Epithelial sodium channel，ENaC)是非電壓門控的阿米洛利敏感性異側離子通道，廣泛存在于多個組織器官，對Na+有高度特異性，可使Na+通過下調自身電化學梯度進入細胞。功能性表達及生化資料顯示，ENaC是一種跨膜蛋白，有3個同源的亞單位：α、β和γ—ENaC。大量研究證實，γ—ENaC是腎臟ENaC發(fā)揮主要調節(jié)作用的亞單位。 內髓集合管(Inner medullary c

3、ollecting duct，IMCD)是哺乳動物集合管的終末部位，為控制Na+排泄的最后節(jié)段。IMCD中直接參與滲透平衡和酸堿平衡調節(jié)的是IMCD細胞。ENaC在腎臟主要分布在遠曲小管和集合管，而IMCD管腔側ENaC在維持機體對Na+的重吸收、體液平衡及血壓調節(jié)中起著關鍵作用。臨床和基礎研究均發(fā)現(xiàn)，IMCD中ENaC活性增加導致的水鈉潴留是高血壓鹽敏感性發(fā)生機制的關鍵環(huán)節(jié)。已經(jīng)證實ENaC基因變異可導致遺傳性高血壓或低血壓。盡管目前

4、ENaC的調控機制尚不清楚，尋找IMCD中ENaC的調控因子一直是本領域的研究熱點。 EETs(環(huán)氧二十碳烯酸，Epoxyeicosatrienoic acids)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)主要通過細胞色素P—450(cytochrome P—450，簡稱CYP)表氧化反應生成的產(chǎn)物，包括5，6-，8，9-，11，12-和14，15-EET。CYP2C23是大鼠腎臟CYP主要亞型。EETs可以直接擴

5、張血管因而具有很強的調控血壓效應，被認為是內皮源性超極化因子(endothelium—derived hyperpolarizing factors，EDHFs)，其擴血管效應在高血壓的病理生理作用已得到肯定。近年研究還發(fā)現(xiàn)EETs對多種離子通道，包括Na+通道具有調控效應。已經(jīng)證實EETs可以通過在腎臟促進尿鈉排泄而達到調控血壓效應，而這一效應是通過調節(jié)腎臟集合管ENaC轉運能力來實現(xiàn)的。EETs對ENaC活性的調控作用是當前研究熱點

6、，但國內相關研究甚少。 此外IMCD處于全身滲透壓變化跨度最大的腎臟內髓組織，其中Na+是構成滲透壓的重要因素。ENaC活性改變會直接影響細胞膜兩側Na+濃度，有研究表明ENaC可能受細胞內Na+反饋性調節(jié)；IMCD細胞中ENaC的存在已經(jīng)被證實，但細胞外Na+對IMCD細胞ENaC表達是否有影響，國內外報道甚少。以往對ENaC的研究大都建立在動物模型基礎上，或采用微穿刺和微灌注等方法來探討EETs對腎臟ENaC活性的調控作用；

7、但由于腎小管的不同節(jié)段對鈉離子的調控作用不同，且涉及多種離子通道；既往研究大多集中在皮質腎小管，而相關的體外研究EETs對IMCD細胞ENaC活性的調控作用國內外還尚屬空白，因此本實驗旨在探討EETs和不同氯化鈉滲透壓環(huán)境對體外培養(yǎng)的原代IMCD細胞ENaC的調控作用。 第1章不同滲透壓環(huán)境對IMCD細胞增殖活性和ENaC表達的影響 研究目的：探討不同滲透壓環(huán)境對大鼠IMCD細胞增殖活性和ENaC表達的影響。 材

8、料與方法： 1.采用膠原酶消化和低滲溶解法分離培養(yǎng)雄性SD大鼠原代IMCD細胞，予含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。所有實驗均取第二代對數(shù)生長期細胞。用免疫熒光技術檢測IMCD細胞中α、β和γ—ENaC的表達部位。 2.模擬IMCD細胞的體內環(huán)境，通過增加細胞外液中Na+濃度造成高滲環(huán)境，降低Na+濃度造成低滲環(huán)境。IMCD細胞在正常培養(yǎng)基中生長72h(融合至80％以上)

9、后，分為三組，分別更換培養(yǎng)基為低滲培養(yǎng)基(200mOsmol/kgH2O，等滲培養(yǎng)基+純水)，等滲培養(yǎng)基(300mOsmol/kgH2O，普通DMEM/F12培養(yǎng)液)或高滲培養(yǎng)基(600mOsmol/kgH2O，等滲培養(yǎng)基+9％NaCl)；三種培養(yǎng)基胎牛血清終濃度均為10％。在12h和24h分別應用MTT法(噻唑藍)檢測活細胞數(shù)目、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率，評價IMCD細胞的滲透壓耐受性，并分別收集各組細胞蛋白用Western B

10、lot法(免疫印跡法，簡稱WB法)半定量檢測β—ENaC和γ—ENaC的表達水平。WB結果用凝膠圖象處理系統(tǒng)Quantity One4.4.0對膠片進行掃描測量感光區(qū)帶的感光密度，并進行積分處理。 結論： 1.高滲環(huán)境可以抑制IMCD細胞增殖，誘導其凋亡，12h作用較顯著；而24h時低滲環(huán)境對IMCD細胞的抑制增殖和誘導凋亡效應增加； 2.細胞外氯化鈉滲透壓的改變不能調控IMCD細胞ENaC表達。 第2章

11、 EETs對IMCD細胞ENaC表達的調控作用 研究目的：探討外源性11，12-EET和CYP2C23-EGFP重組腺病毒轉染對大鼠IMCD細胞γ-ENaC表達的影響，旨在為EETs調節(jié)機體水鈉負荷和血壓鹽敏感性提供實驗基礎和理淪依據(jù)。 材料與方法： SD大鼠原代IMCD細胞培養(yǎng)：參見第1章。 外源性11，12-EET：購自美國sigma公司，100ug/ml，純度：98％。 CYP2C23-

12、EGFP重組腺病毒：1×1012VP/ml，大鼠源性的CYP2C23-pBluescript SK+/-，由QBIOgene公司完成克隆載體CYP2C23-IRES2-EGFP的構建、鑒定，以及感染HEK293細胞后擴增、CsC1密度梯度超速離心純化。 1.外源性11，12-EET干預實驗：將IMCD細胞按1.0×106cell/孔接種于6孔板中，在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合80％以上后使用，設實驗組(三組，11，12-E

13、ET不同濃度)和空白對照組(正常培養(yǎng)基)，實驗組按終濃度為10ng/ml、100ng/ml與1000ng/ml分別更換為5ml含有11，12-EET的DMEM/F12培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基中胎牛血清終濃度均為10％，并繼續(xù)置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在12h和24h分別收集細胞蛋白，WB法半定量檢測各組β-ENaC和γ-ENaC的表達水平。 2.CYP2C23-EGFP重組腺病毒轉染IMCD細胞實驗：將IMCD細胞按1.0×

14、106 cell/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至60％-70％左右融合時使用，設實驗組(三組，CYP2C23-EGFP不同轉染滴度)和對照組(高滴度對照腺病毒：購自QBIOgene公司，不含有CYP2C23和EGFP)，實驗組按0.4×109、2.0×109與4.0×109的病毒顆粒分別加入5ml含有CYP2C23-EGFP重組腺病毒的DMEM/F12培養(yǎng)基，對照組加入5ml含對照腺病毒顆粒4.0×109的DMEM/F12培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基中

15、胎牛血清終濃度均為5％，并繼續(xù)置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在12h和24h，熒光倒置顯微鏡下觀察CYP2C23-EGFP重組腺病毒轉染IMCD細胞后的熒光表達強度，熒光強度平均積分光密度使用Image-Pro Plus6.0軟件定量分析。病毒轉染滴度與轉染細胞熒光表達強度的相關性分析采用Spearman等級相關。高倍鏡下計算各組病毒體外轉染率，并分別收集各組細胞蛋白，WB法半定量檢測各組γ-ENaC的表達水平。 結論：