替米沙坦對NAFLD大鼠肝臟及大網(wǎng)膜脂肪組織中PPARγ表達的影響.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fat liver disease，NAFLD)是排除病毒，乙醇，化學(xué)物質(zhì)，放射線及自身免疫性疾病等損肝因素所致的以肝細胞脂肪變性為主要病理改變的慢性肝臟疾病。其病理過程大致分為單純性脂肪肝，脂肪性肝炎，脂肪性肝硬化3個類型。NAFLD與遺傳、環(huán)境、代謝等因素有關(guān)，美國內(nèi)分泌醫(yī)師協(xié)會已將其列為代謝綜合征(matebolic syndrome，MS)，的組成成分之一。近年來，隨著生活方式

2、和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD發(fā)病率有逐漸上升的趨勢，目前已成為嚴重危害人類健康的肝臟疾病之一。NAFLD的發(fā)病機理目前存在“二次打擊”學(xué)說：第一次打擊涉及胰島素抵抗，由于機體的自我防御機制，此階段可有抗細胞凋亡通路的活化，脂聯(lián)素、IL-6等抗炎因子的表達增加，因此病變存在可逆性；第二次打擊主要是活性氧代謝產(chǎn)物的增加所致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，ROS與生物膜的磷脂等多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈結(jié)合，導(dǎo)致生物膜的流動性改變，通透性增加，核酸、酶等大分子功

3、能受損，使脂肪變性的肝細胞發(fā)生凋亡壞死。
　　作為NAFLD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，胰島素抵抗已成為很多藥物治療該病的靶點。白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)是機體重要的內(nèi)分泌器官，脂肪細胞因子水平(如IL-8，NGF)上升與代謝異常及胰島素抵抗存在因果關(guān)系，并導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積。PPARγ是一種配體激活的核激素受體，在白色脂肪組織中高表達，具有調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，誘導(dǎo)脂肪細胞分化的作用，在前脂肪細胞到成熟脂肪細胞

4、的演變過程中表達量逐漸增加，影響著脂肪細胞的生長發(fā)育和功能狀態(tài)，進而影響白色脂肪組織的內(nèi)分泌功能。適度抑制其表達可以起到減輕胰島素抵抗的作用。解耦連蛋白2(uncoupling protein2，UCP2)屬于解耦連蛋白家族，可以介導(dǎo)質(zhì)子躍遷，使能量以熱能的形式釋放，減輕細胞氧化應(yīng)激，在生熱及能量代謝中意義重大。NAFLD時，UCP2表達量增加，是一種適應(yīng)性反應(yīng)。
　　替米沙坦，一種傳統(tǒng)的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，不僅可以抑制AT1

5、受體，還可作為PPARγ的部分激動劑，起到減輕胰島素抵抗的作用。有研究證實替米沙坦可促進肝組織中PPARγ的表達，但在白色脂肪組織中起何種作用目前尚未有研究報道。本實驗應(yīng)用高脂飲食建立NAFLD胰島素抵抗大鼠模型，觀察觀察替米沙坦干預(yù)前后血脂血糖，胰島素敏感性，轉(zhuǎn)氨酶的變化情況，并檢測肝組織及大網(wǎng)膜組織PPARγ及肝組織中UCP2的表達變化，探討替米沙坦治療NAFLD的機制。
　　方法：
　　1.動物模型的制備：選取雄性(S

6、prague Dawley)SD大鼠，正常對照組喂飼普通飼料，高脂對照組飼以84％普通飼料+高脂飼料，配方為：1％膽固醇、5％蛋黃粉、10％豬油，實驗動物自由進食及飲水。
　　2.實驗分組：將SD大鼠40只隨機分為正常對照組(NC group，n=15)、高脂對照組(FC group，n：15)，高脂+替米沙坦干預(yù)組(FT group，n=10)。飼養(yǎng)12周末時隨機取NC及FC組各5只做高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗及肝組織的HE染色，

7、確定造模成功。后FT組給予替米沙坦(5mg/kg.d)灌胃并予高脂飲食，正常及高脂對照組則以等容量的生理鹽水灌服，每日一次，共持續(xù)4周。
　　3.大鼠體重、肝濕重和肝指數(shù)的變化：應(yīng)用電子天平稱取體重及肝濕重，并根據(jù)以下公式計算肝指數(shù)：肝濕重/體重×100％。
　　4.胰島素敏感性測定：我們以高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗技術(shù)(euglycermic hyperinsulinemia clamp technique)在穩(wěn)態(tài)時葡萄糖的

8、輸注速率(GIR)來評估胰島素的敏感性。
　　5.肝組織學(xué)檢查：應(yīng)用石蠟切片，采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色的方法，在光鏡下觀察肝臟病理學(xué)的變化情況。
　　6.大網(wǎng)膜組織中PPARγmRNA，肝組織中PPARγmRNA、AT1 mRNA及UCP2 mRNA表達：采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法，平行觀察肝組織/大網(wǎng)膜組織(WAT)PPARγmRNA含量變化及肝組織PPAR

9、γ、AT1、UCP2 mRNA的表達水平變化。采用磷鉬酸比色法測定肝組織ATP含量。
　　7.血清生化學(xué)的檢測：取血清樣本，在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生化室的協(xié)助下，應(yīng)用全自動血清生化分析儀檢測轉(zhuǎn)氨酶及血脂等生化指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠的體重、肝濕重和肝指數(shù)的變化：在16周末成功的復(fù)制了大鼠NASH的模型。FC組的大鼠體重(597.51±15.62)、肝濕重(21.93±1.65)和肝指數(shù)(3.67±0.

10、23％)均明顯的高于NC組的體重(523.37±18.43)、肝濕重(12.39±0.96)和肝指數(shù)(2.37±0.17％)(P<0.01)，差異顯著。而FT組的體重(559.65±15.80)、肝濕重(16.10±1.13)和肝指數(shù)(2.88±0.17％)均明顯低于模型組(P<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.關(guān)于胰島素敏感性的變化：各組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩比較結(jié)果顯示，NC組明顯高于其它兩組，而FT組高于FC組。

11、r>　　3.肝組織病理學(xué)的變化情況：NC組無肝細胞脂肪變性，且未見炎細胞浸潤；而FC組出現(xiàn)了彌漫性的肝細胞脂肪變性，中央靜脈周圍最為顯著，并可見程度不一的小葉內(nèi)炎癥和匯管區(qū)的炎癥，點灶狀壞死，部分壞死甚至融合成片，與正常對照組相比差異顯著(P<0.01)。FT組肝細胞脂肪變性分級與FC組相比明顯改善(P<0.05)，炎癥分級與FC組相比明顯的降低(P<0.05)。
　　4.血清生化指標(biāo)的變化：(1)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和

12、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)：FC組ALT(97.57±9.02)較正常組(43.14±8.38)顯著升高(P<0.01)，而FT組ALT(71.00±10.41)較FC組顯著下降(P<0.01)，但與NC相比仍有差異(P<0.01)。FC組AST(221.00±26.52)較NC組(121.86±10.35)顯著增高(P<0.01)，F(xiàn)T組AST(153.29±16.46)較FC組下降(P<0.01)。(2)血清總膽固醇(TC)、甘油

13、三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)：FC血清TC、TG(1.41±0.17，0.73±0.17)較正常組(0.78±0.16，0.27±0.08)顯著升高(P<0.01，0.01)，F(xiàn)T組TC、TG(1.22±0.24，0.60±0.13)較FC組下降，但無顯著性差異(P>0.05)；FC組HDL-C(0.73±0.07)較NC組(0.92±0.05)顯著下降(P<0.01)，而FT組HDL-C(0.79±0.04)較FC組

14、有所上升，但無顯著性差異(P>0.05)。(3)血糖：FC組空腹血糖(11.88±2.13)與NC組相EE(5.53±1.13)明顯升高(P<0.01)，F(xiàn)T組空腹血糖(9.22±1.40)較FC組下降，有顯著性差異(P<0.05)。
　　5.PPARγ、AT1R和UCP2 mRNA表達：(1)肝組織PPARγmRNA變化：與NC組mRNA(0.389±0.014)相比，F(xiàn)C組(0.167±0.015)顯著降低(P<0.01)；F

15、T組(0.308±0.018)較FC組明顯升高(P<0.01)。(2)大網(wǎng)膜組織PPARγmRNA變化：與NC組mRNA(0.185±0.014)相比，F(xiàn)C組(0.476±0.082)顯著升高(P<0.01)；FT組(0.291±0.010)較FC組明顯降低(P<0.01)。(3)UCP2 mRNA變化：與NC組mRNA(0.198±0.016)相比，F(xiàn)C組(0.321±0.022)顯著升高(P<0.01)；FT組(0.342±0.01

16、6)高于NC組，差別不具有顯著性。(4)AT1R mRNA變化：與NC組mRNA(0.198±0.016)相比，F(xiàn)C組(0.321±0.022)顯著升高(P<0.01)；FT組(0.342±0.016)較FC組升高，但無顯著性差異(P值>0.05)。
　　6.肝組織ATP含量：FC組(3.54±0.81)較NC組(5.50±0.59)降低，具有顯著性差異(P<0.01)；FT組(3.39±0.53)較FC組有降低趨勢，但差別不具有