人NK-T細胞淋巴瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1對吉西他濱和阿霉素細胞毒作用的相關(guān)性研究.pdf

1、【背景與目的】
　　淋巴瘤(Malignant Lymphoma，ML)是一組源自造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，淋巴結(jié)或結(jié)外淋巴組織或器官原發(fā)，國人多見NHL(淋巴瘤的兩種分類之一，非霍奇金淋巴瘤)。NK/T細胞淋巴瘤(NK/T cell Lymphomas)是來源于T細胞的 NHL，該病侵襲性高、病程短、療效差、死亡率高，以放化療為主，但對阿霉素（Adriamycin，ADM）為基礎(chǔ)的傳統(tǒng) CHOP方案療效不敏感。核苷類似藥物

2、吉西他濱（gemcitabine）自問世以來一直是各種類型實體腫瘤（如胰腺癌、膽管癌和乳腺癌等）化療方案中的基礎(chǔ)藥，已取得不凡的臨床療效。近年來，以吉西他濱為基礎(chǔ)的化療方案應(yīng)用于NK/T細胞淋巴瘤病人的治療后，臨床治療效果明顯優(yōu)于無吉西他濱藥物的化療方案，但仍有部分NK/T細胞淋巴瘤病人出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。但無論在實體腫瘤還是淋巴瘤臨床研究中，吉西他濱藥物敏感性和耐藥性的決定因素尚未明晰。
　　細胞內(nèi)代謝是核苷類似藥物發(fā)揮其毒性作用的必

3、要步驟，但前提是藥物必須首先完成其跨膜轉(zhuǎn)運，這一步驟對于核苷類似藥物來說，是實現(xiàn)其藥效必不可少的。故近年來對膜轉(zhuǎn)運蛋白的研究越來越多，研究認為，藥物療效的發(fā)揮離不開膜轉(zhuǎn)運蛋白的介導(dǎo)，其轉(zhuǎn)運效率直接決定藥物的治療效果，甚至將其作為藥物療效和腫瘤病人存活長短的生物標志物。人均衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1(human equilibrium nucleoside transporter1，hENT1)蛋白是近來膜轉(zhuǎn)運蛋白研究的熱點之一，其研究方向主要在

4、其介導(dǎo)抗腫瘤藥物和抗病毒藥物方面。目前，實體瘤研究認為，吉西他濱的跨膜轉(zhuǎn)運是一個幾乎完全由轉(zhuǎn)運蛋白hENT1介導(dǎo)的過程，該蛋白是決定吉西他濱藥物敏感度的決定因素，但對阿霉素沒有相關(guān)研究。
　　hENT1(SLC29A1)是核苷轉(zhuǎn)運家族SLC29（the solute carrier29）發(fā)現(xiàn)的第一個成員，hENT1是承擔(dān)機體生理性核苷和多種抗癌、抗病毒核苷類似藥物的細胞吸收和（或）細胞排出的主要跨膜載體。根據(jù)細胞對NBTI/NBM

5、PR的敏感特性，hENT1蛋白被分為 NBMPR敏感型(es)和 NBMPR不敏感型(ei)兩類。近5年來，關(guān)于hENT1與抗癌藥物治療關(guān)系的臨床研究大多集中在：腫瘤組織標本免疫組化檢測hENT1蛋白高表達與癌癥病人的長期生存有關(guān)；檢測hENT1蛋白表達程度來評估腫瘤病人對核苷類似藥物的敏感性和耐藥性；hENT1蛋白能否作為核苷類似藥物的治療靶點；大多數(shù)實體瘤研究數(shù)據(jù)顯示，核苷類似藥物（如吉西他濱）通過hENT1蛋白介導(dǎo)實現(xiàn)了高效的藥物

6、跨膜轉(zhuǎn)運，能作為核苷類似藥物治療癌癥病人的生物標志物之一；但部分研究對此持不同意見；故 hENT1蛋白在核苷類似藥物治療實體瘤病人的生物標志物價值仍保持著爭議。
　　在PubMed檢索中，hENT1蛋白水平、基因水平研究的文獻不多，基礎(chǔ)研究多于臨床研究，臨床研究多集中在胰腺癌和膽管壺腹癌；在人NK/T淋巴瘤細胞株YTS上hENT1蛋白與吉西他濱、阿霉素的相關(guān)功能、蛋白水平和基因水平的研究，在PubMed、中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)中未檢索

7、到相關(guān)文獻。
　　本實驗擬采用CCK-8技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)，檢測膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1與抗癌藥物吉西他濱、阿霉素對人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS的細胞毒作用的相關(guān)性，探討在NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS中，膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1是否為介導(dǎo)吉西他濱、阿霉素進入癌細胞的主要通道蛋白及其功能特性。
　　【材料與方法】
　　1.研究對象
　　人 NK/T細胞淋巴瘤細胞株 YTS膜均衡

8、型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1( hENT1， SLC29A1)。
　　2.研究方法
　　本研究采用CCK-8技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)(Q-rt-PCR)和Western Blot技術(shù)，通過膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1與抗癌藥物吉西他濱、阿霉素對人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS的細胞毒作用的相關(guān)性檢測，運用統(tǒng)計學(xué)方法，對hENT1進行功能、基因和蛋白水平上的研究。
　　3.CCK-8檢測
　　采用CCK-8技術(shù)，結(jié)合hENT1的小

9、分子特異抑制劑NBMPR，通過hENT1與抗癌藥物吉西他濱、阿霉素對人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS的細胞毒作用的相關(guān)性，檢測人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1的功能。
　　4.實時熒光定量PCR檢測
　　采用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過hENT1與抗癌藥物吉西他濱、阿霉素對人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS的細胞毒作用的相關(guān)性，運用統(tǒng)計學(xué)方法，研究人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1在基因水

10、平上的變化情況。并運用該技術(shù)檢測了淋巴瘤細胞株YTS、SNK-6、Jeko-1、ly1、Raji、Karpas和Jurket中的hENT1在基因水平上的表達。
　　5.Western Blot檢測
　　采用Western Blot技術(shù)，檢測了淋巴瘤細胞株YTS、SNK-6、Jeko-1、ly1、Raji、Karpas和Jurket中的hENT1在蛋白水平上的表達。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計

11、軟件，兩組比較采用t檢驗；檢驗水準為α=0.05。
　　【結(jié)果】
　　1.膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1在細胞株YTS、SNK-6、Jeko-1、ly1、Raji、Karpas和Jurket中的表達研究
　　Q-RT-PCR檢測結(jié)果顯示：hENT1在細胞株YTS、SNK-6、Jeko-1、ly1、Raji、Karpas和Jurket中均有表達，表達量不均，YTS、Jeko-1表達相對低，其余表達較高。
　　Western

12、Blot檢測結(jié)果顯示：hENT1蛋白在細胞株YTS、SNK-6、Jeko-1、ly1、Raji、Karpas和Jurket中均有表達，表達量不均。
　　2.人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1功能的檢測
　　在吉西他濱、阿霉素藥物作用組，隨藥物作用時間延長，其細胞毒性明顯增強，即兩種藥物對 YTS的細胞毒作用存在時間依賴性；但預(yù)先加入 NBMPR作用后，首先細胞毒作用明顯減弱，甚至不起作用，其次時間依賴性不存

13、在。先NBMPR作用+藥物作用組與單純藥物作用組，無論吉西他濱、阿霉素，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。低濃度NBMPR（5nM/L、10nM/L和20nM/L）即可明顯減弱吉西他濱、阿霉素對YTS的細胞毒作用。
　　3.人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1與吉西他濱細胞毒作用的相關(guān)性研究
　　CCK-8結(jié)果顯示：1）吉西他濱對YTS細胞的IC50值為25.63nM/L；2）吉西他濱對YTS的細

14、胞毒作用隨作用時間的延長和藥物濃度加大而明顯增強。不同時間和不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.05），即吉西他濱對YTS的細胞毒作用存在時間和濃度依賴性。3）加NBMPR作用后，吉西他濱的毒性作用改變明顯；隨作用時間延長，其細胞毒性幾乎不顯現(xiàn)。NBMPR作用+藥物作用組與單純藥物作用組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　Q-RT-PCR檢測結(jié)果顯示了吉西他濱作用YTS細胞后hENT1在mRNA

15、水平的變化情況。不同濃度吉西他濱作用YTS細胞后3小時、6小時后hENT1基因相對表達量2-△△Ct值，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但3小時、12小時組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；即隨吉西他濱對淋巴瘤細胞株YTS的作用的時間延長、濃度增加，6小時左右，hENT1基因顯著增加；但隨后的增加出現(xiàn)下降趨勢。
　　4.人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1與阿霉素細胞毒作用的相關(guān)性研究
　　C

16、CK-8結(jié)果顯示：1）阿霉素對YTS細胞的IC50值為400nM/L；2）阿霉素對YTS的細胞毒作用隨作用時間的延長和藥物濃度加大而明顯增強。不同時間和不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.05），即阿霉素對YTS的細胞毒作用存在時間和濃度依賴性。3）加NBMPR作用后，阿霉素的毒性作用改變明顯；隨作用時間延長，其細胞毒性幾乎不顯現(xiàn)。NBMPR作用+藥物作用組與單純藥物作用組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

17、。
　　Q-RT-PCR檢測結(jié)果顯示了阿霉素作用YTS細胞后hENT1在mRNA水平的變化情況。不同濃度阿霉素作用 YTS細胞后3小時、6小時之間，3小時、12小時之間，hENT1基因相對表達量2-△△Ct值組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.05）；即3、6、12小時，hENT1基因隨阿霉素對淋巴瘤細胞株YTS的作用的時間延長、濃度增加而增加。
　　【結(jié)論】
　　1.在功能、基因水平證實NK/T細胞淋巴

18、瘤細胞株YTS膜轉(zhuǎn)運蛋白hENT1可能是介導(dǎo)吉西他濱、阿霉素進入的主要通道蛋白。
　　2.在吉西他濱作用時，YTS細胞的hENT1 mRNA隨時間延長、濃度增加而增加，上升趨勢在6小時左右出現(xiàn)下降；在阿霉素作用時，YTS細胞的hENT1 mRNA隨時間延長、濃度增加而增加，hENT1 mRNA在12小時左右仍處上升趨勢。
　　3.低濃度hENT1的抑制劑NBMPR可明顯抑制吉西他濱、阿霉素對YTS細胞的細胞毒作用，YTS細胞