地西他濱對多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266、淋巴瘤細胞株Jurkat增殖凋亡影響的實驗研究.pdf

1、目的:地西他濱(decitabine，DAC)，是一種核苷類似物，磷酸化的地西他濱參與DNA合成，然后與DNA甲基轉移酶(DNMTs)共價結合，抑制DNMTs活性，從而達到DNA去甲基化，激活抑癌基因最終可起到腫瘤細胞分化或凋亡的作用。FDA已經(jīng)正式批準地西他濱用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)。地西他濱對難治性急性髓系白血病的治療近期也屢見報道。而地西他濱對淋巴系統(tǒng)腫瘤的治療研究報道較少。
　　 國內外研究已證實淋巴瘤患者及

2、其細胞系中存在異常的高度甲基化，經(jīng)常發(fā)生于富于CpG島的腫瘤抑制基因（如P15INK4B基因，SHP-1基因，P53基因）啟動子區(qū)，并導致該基因的沉默?；A研究表明DAC能夠誘導淋巴瘤細胞株Raji中P15INK4B基因去甲基化并使其表達增強，從而抑制腫瘤細胞增殖。最近研究顯示，Gore和Garcia—Manero分別報道用5-氮胞苷和丁酸苯酯、地西他濱和丙戊酸（丁酸苯酯、丙戊酸為組蛋白乙?；敢种苿┞?lián)合用藥，對白血病和T細胞淋巴瘤患

3、者進行一、二期臨床試驗時均顯示出明顯的協(xié)同效應。并有研究顯示在體內，地西他濱能增加細胞對生物治療的敏感性，如維甲酸，并增加凋亡因子的表達。
　　 多發(fā)性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)，為發(fā)生于B淋巴細胞的惡性漿細胞病，依現(xiàn)在醫(yī)療水平仍未能達到治愈。T細胞淋巴瘤(T-celllymphoma)，即T細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)好發(fā)于亞洲地區(qū)，與B細胞來源的NHL一樣具有侵襲性，是一種來源于T淋巴細胞的惡性克隆增殖性

4、疾病，預后更差。雖T細胞NHL經(jīng)常規(guī)治療后部分患者達到緩解，但緩解期短，短期之內可出現(xiàn)復發(fā)或進展，目前復發(fā)或難治性T細胞NHL，尚無標準的挽救治療方案。需尋找有效藥物及其聯(lián)合治療方案以提高T細胞淋巴瘤患者療效及改善預后。當前表觀遺傳學對腫瘤的治療作用越來越受到關注，其中主要包括去甲基化治療。
　　 為進一步探討地西他濱對淋巴系統(tǒng)腫瘤細胞增殖及促凋亡的機制，本實驗選用多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266，人類T細胞淋巴瘤Jurkat細胞株，

5、分別觀察地西他濱對U266細胞株，Jurkat細胞增殖的抑制以及誘導凋亡作用及影響。
　　 此外，T淋巴細胞參與免疫應答，它們在對腫瘤細胞的殺傷以及抑制腫瘤生長中起著不可忽視的作用。T淋巴細胞可分為T輔助淋巴細胞(Th)和T殺淋巴細胞(Tc)兩大類。Th1型細胞因子包括INF-α、IL-2和腫瘤壞死因子β(tumornecrosisfactor-β，TNF-β)介導細胞的免疫應答，對機體抗病毒、抗腫瘤起著重要的作用;TH2類細胞

6、因子主要包括，IL-4、IL-6、IL-10等，可能還包括IL-9，介導體液免疫應答，與抑制自身免疫、移植物耐受、抗排斥反應有關。目前研究顯示，淋巴細胞可以通過細胞因子INF-α、TNF等活化的Th和Tc細胞進行效地抑制惡性腫瘤細胞的生長，而大部分存在腫瘤的患者往往免疫功能很低下，據(jù)研究報道這主要原因是由于腫瘤細胞分泌免疫抑制因子，而抑制了T淋巴細胞的功能。地西他濱對T淋巴細胞功能的影響，目前還未見報道。Jurkat是humanT淋巴瘤

7、細胞系，可以分泌IL4、IFN-α和IL-10，我們以Jurkat細胞為做為體外研究T細胞分化的模板，模擬地西他濱對T淋巴細胞功能的影響。檢測DAC對T細胞分泌的細胞因子IL-4，IL-10及INF-α水平的影響，進而為惡性淋巴瘤患者的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、常規(guī)方法培養(yǎng)U266細胞株，人T細胞淋巴瘤Jurkat細胞株，每24小時傳代一次。選用對數(shù)期細胞進行試驗。
　　 2、CCK-8法檢

8、測不同濃度的地西他濱對U266細胞，Jurkat淋巴瘤細胞增殖的影響:首先依據(jù)查詢文獻，我們將DAC的濃度設置為(1、2、3、5、10、20、50、100、150、200、250、500μg/ml)分別作用于上述兩種細胞進行預實驗，我們分別算出作用兩種細胞兩藥48h細胞增殖抑制50％的藥物濃度(IC50)，并根據(jù)兩種細胞的IC50，我們選用附近濃度得出50、100、250μg/ml作用于U266細胞;得出2、5、10μg/mL于作用Ju

9、rkat細胞。分別作用24h、48h、72h觀察U266細胞及Jurkat細胞的抑制率
　　 3、AnnexinV/PI雙染法檢測不同濃度的地西他濱對U266細胞，Jurkat淋巴瘤細胞凋亡的影響，藥物作用濃度同CCK-8實驗，觀察單藥作用24h、48h、的凋亡率;
　　 4、應用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)實驗，藥物作用濃度同CCK-8實驗，觀察地西他濱作用48h的Jurkat淋巴瘤細胞分泌IL-4，IL-10及INF-

10、α細胞因子的表達量變化;
　　 5、統(tǒng)計學分析:SPSS13.0軟件進行分析，分組資料的表示用均數(shù)±標準差，兩組比較應用t檢驗，多組比較應用單因素方差分析，P＜0.05為有差異，提示有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、地西他濱對U266細胞增殖抑制及細胞凋亡的影響
　　 CCK-8法檢測顯示，不同濃度的DAC作用24h、48h、72h后的U266細胞，發(fā)現(xiàn)可以抑制細胞增值，增殖抑制率由23.6±0.1

11、2％增加到65.06±0.03％，呈劑量和時間的依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。流式細胞術分析結果顯示，DAC作用于U266細胞，隨時間延長和藥物濃度的增加，細胞凋亡率由9.7±0.74％增加到69.4±0.24％。DAC促U266細胞凋亡呈時間劑量依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、地西他濱對Jurkat細胞增殖抑制及細胞凋

12、亡的影響
　　 CCK-8法檢測顯示，不同濃度的DAC作用24h、48h、72h后的U266細胞，發(fā)現(xiàn)可以抑制細胞增值，增殖抑制率由17.53±0.02％增加到83.63±0.57％，呈劑量和時間的依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。流式細胞術分析結果顯示，DAC作用于Jurkat細胞，隨時間延長和藥物濃度的增加，細胞凋亡率由9.7±0.74％增加到69.4±0.24％。DAC促Jur

13、kat細胞凋亡呈時間劑量依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、地西他濱對Jurkat細胞功能的影響
　　 應用酶聯(lián)免疫法分析結果顯示，地西他濱可誘導促進Jurkat細胞分泌細胞因子，低濃度組地西他濱可明顯促進IL-4分泌，Th1/Th2比值下降，增強免疫耐受功能;中、高濃度組地西他濱可明顯促進INF-α分泌，Th1/Th2比值明顯上升，增強抗腫瘤功能。統(tǒng)計學分析顯示空

14、白對照組與處理組之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)
　　 結論:
　　 1、地西他濱可抑制U266細胞的增殖，并促進U266細胞凋亡，呈時間和劑量依賴性。
　　 2、地西他濱可抑制Jurkat淋巴瘤細胞增殖，并促進Jurkat細胞凋亡，呈時間和劑量依賴性。
　　 3、地西他濱可促進T淋巴細胞分泌IL-4，IL-10及INF-α細胞因子，低濃度組地西他濱可使Th1/Th2比值下降，增強免疫耐受功能。中高濃度組