冬凌草甲素和熊果酸對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266的抗腫瘤作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:1.證明萜類化合物冬凌草甲素(Oridonin，Ori)和熊果酸(UsolicAcid，UA)可以抑制人多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)細(xì)胞株U266增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。2.進(jìn)一步對冬凌草甲素和熊果酸發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)合上述兩個(gè)部分，為多發(fā)性骨髓瘤藥物治療方案的探索提供理論依據(jù)。
　　方法:設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（濃度梯度組、時(shí)間梯度組）和對照組。濃度梯度實(shí)驗(yàn)組即用不同濃度冬凌草甲素或熊果酸處理

2、細(xì)胞，時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)組即用藥后培養(yǎng)細(xì)胞至不同時(shí)間點(diǎn)。對照組加入實(shí)驗(yàn)組最大濃度DMSO處理。1.CCK-8法檢測冬凌草甲素或熊果酸（0、5、10、20、50μmol/L處理細(xì)胞0、12、24、48、72h）對U266細(xì)胞生長抑制率的影響。2.對細(xì)胞行瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察冬凌草甲素10μmol/L或熊果酸20μmol/L處理細(xì)胞24h后U266細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。3.TUNEL細(xì)胞凋亡檢測法定性檢測藥物濃度(0、2.5、5、10、20、5

3、0μmol/L)和作用時(shí)間(0、12、24、48、60、72h)對細(xì)胞凋亡的影響。4.流式細(xì)胞術(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證藥物濃度（0、2.5、5、10、20、50μmol/L）和作用時(shí)間(12、24、48、72h)對細(xì)胞凋亡率的影響。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescencequantitative PCR)方法檢測藥物對U266細(xì)胞中FGFR3-P13K/Akt信號通路相關(guān)基因FGFR3、MDM2、BCL2、CCND1、

4、MYC、P53和Bax mRNA表達(dá)水平的影響。6.蛋白印跡(Western Blot，WB)方法分析藥物對U266細(xì)胞中FGFR3-P13K/Akt信號通路相關(guān)蛋白FGFR3、MDM2、BCL2、CCND1、C-MYC、P53和Bax的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:1.冬凌草甲素和熊果酸能夠抑制U266細(xì)胞增殖，且該作用呈濃度和時(shí)間依賴性，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在藥物濃度20μmol/L，作用時(shí)間48

5、h時(shí)，細(xì)胞生長抑制率達(dá)到50％;50μmol/L藥物處理72h后，細(xì)胞的生長抑制率已經(jīng)接近100％。2.冬凌草甲素或熊果酸處理U266細(xì)胞24小時(shí)后，光學(xué)顯微鏡下可觀察到單個(gè)細(xì)胞的胞體縮小、與其它細(xì)胞連接減少、胞膜小泡狀形成、胞質(zhì)空泡出現(xiàn)、核質(zhì)濃縮、核膜核仁破碎等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變;3.實(shí)驗(yàn)組U266細(xì)胞的凋亡率較對照組有所增加，且該作用呈濃度依賴性(冬凌草甲素DMSO(2.5±0.28)％、2.5μmol/L(3.0±1.70)

6、％、5μmol/L(15.1±4.10)％、10μmol/L(27.3±1.27)％、20μmol/L(38.6±4.38)％、50μmol/L(98.1±0.42)％;熊果酸DMSO(6.6±0.85)％、2.5μmol/L(8.2±0.71)％、5μmol/L(10.1±3.86)％、10μmol/L(29.3±3.82)％、20μmol/L(44.2±2.97)％、50μmol/L(97.0±1.84)％)和時(shí)間依賴性(冬凌草甲素

7、12h(9.3±0.14)％、24h(22.7±0.56)％、48h(32.1±0.94)％、72h(71.2±3.61)％;熊果酸12h(10.4±2.26)％、24h(17.8±1.13)％、48h(67.0±7.28)％、72h(88.5±5.80)％);濃度梯度組在50μmol/L時(shí)達(dá)到最高值（冬凌草甲素98.1％，熊果酸97.0％）;時(shí)間梯度組在72h時(shí)達(dá)到最高值（冬凌草甲素71.2％，熊果酸88.5％）;4.經(jīng)冬凌草甲素或熊

8、果酸處理后的U266細(xì)胞中， FGFR3、MDM2、BCL2、CCND1、MYC基因與其相應(yīng)的蛋白表達(dá)下調(diào);P53、Bax基因和其蛋白表達(dá)上調(diào)，上述變化均呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論:1.冬凌草甲素和熊果酸可以呈濃度及時(shí)間依賴性地抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。2.冬凌草甲素和熊果酸對FGFR3及P13K/Akt信號通路中相關(guān)基因和蛋白有明顯抑制作用，該藥可能通過抑制FGFR3-P1