Kupffer細(xì)胞通過TLR4調(diào)控組織因子參與急性胰腺炎凝血系統(tǒng)變化的研究.pdf

1、第一部分、AP患者TF改變對凝血系統(tǒng)的影響
　　目的：動態(tài)監(jiān)測急性胰腺炎患者凝血指標(biāo)及TF和TF-MPs的變化，評價急性胰腺炎患者凝血系統(tǒng)的變化與TF的相關(guān)性，探討TF作為AP早期微循環(huán)障礙的診斷指標(biāo)的作用。
　　方法：選取2013年5月-2014年5月在重慶醫(yī)科大學(xué)附二院住院的急性胰腺炎患者80例。MAP組共有40例患者，男女分別為18和22例，患者中位年齡為（63.3±5.6）歲；SAP組同樣為40例患者，男女分別為16

2、和24例，中位年齡（64.2±6.8）歲；選取相同時間段在本院接受健康體檢的40例正常老年人作為對照組(CON組)，男20例，女20例，平均年齡（63±6.5）歲。入院之后第l、2、7天清晨空腹抽取外周靜脈血，并對凝血指標(biāo)進(jìn)行檢測，具體為：1）PT（凝血酶原時間）；2）FIB（纖維蛋白原）；3）APTT（凝血酶時間）；4）D-D（D-二聚體）,檢測血漿中血淀粉酶及白細(xì)胞，ELISA監(jiān)測血漿中TF的變化,流式細(xì)胞儀測定血漿中TF相關(guān)膜微粒

3、含量。
　　結(jié)果：第1和第2天，MAP組患者的PT、FIB、APTT以及D-D四項指標(biāo)相較于對照組均有顯著上升，差異性較為顯著（P＜0.05），第7天，該組患者上述幾項指標(biāo)和對照組患者較為接近（P＞0.05）。第1,2和第7天，SAP組患者的PT水平相較于對照組患者有顯著地上升，可見統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）.第1，2和第7天內(nèi)，SAP組患者的PT、FIB、APTT、D-D以及BAMY等各項指標(biāo)的上升幅度相較于MAP組均更明顯，組

4、間內(nèi)有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。采用ELISA法對血清中TF進(jìn)行檢測，結(jié)果得出：第1,2和7天三個時段中，MAP組患者的血清TF水平略微高出對照組患者，差異有顯著性（P＜0.05）。SAP組1，2，7天TF水平顯著高于對照組，有顯著性差異（P＜0.01）。第1，2和第7天三個時段，SAP組患者的TF水平要比MAP組患者有較明顯地上升，組間差異性較為明顯（P＜0.05）。根據(jù)流式細(xì)胞儀所得的檢測結(jié)果：上述時段中，MAP組患者的TF-MP

5、s水平相較于對照組患者有顯著地上升，但程度較輕，相比差異性顯著（P＜0.05）。SAP組1，2，7天TF-MPs水平顯著高于對照組，有顯著性差異（P＜0.01）。MAP組與SAP組兩兩比較，第1，2，7天SAP組TF-MPs水平均較MAP組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：SAP患者的凝血和纖溶系統(tǒng)均受到不同程度的影響，TF和TF-MPs與患者的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，如果能夠抑制TF和TF-MPs，推測對患者的凝

6、血、纖溶功能均有一定的改善作用。通過平衡體內(nèi)的微循環(huán)狀態(tài)，可調(diào)節(jié)和改善急性胰腺炎的預(yù)后。
　　第二部分、GdCl3阻斷KCs對AP狀態(tài)下凝血系統(tǒng)的影響
　　目的：觀察大鼠急性胰腺炎TF和TF-MPs及凝血和纖溶系統(tǒng)的變化，探討AP狀態(tài)下KCs的TLR4和TF的表達(dá)對大鼠凝血和纖溶系統(tǒng)的影響。
　　方法：使用SD大鼠共計168只，采用隨機(jī)的方法將其分成7個組別，依次為：1）對照組；2）假手術(shù)(SO)組；3）SO+氯化釓(

7、GdCl3)預(yù)處理組；4）輕型胰腺炎(MAP)組；5）重型胰腺炎(SAP)組；6） MAP+GdCl3組；7）SAP+GdCl3組。通過胰膽管逆行注射的方式對各組大鼠注射牛黃膽酸鈉，濃度分別為1.5%，5%，從而建立起MAP和SAP模型。于手術(shù)結(jié)束后的第6h、12h和24h這三個階段對大鼠進(jìn)行處死，對其血清中的凝血、白細(xì)胞、血淀粉酶的變化進(jìn)行檢測；ELISA法檢測血清中TF水平；流式細(xì)胞儀檢測TF-MPs的表達(dá)；分離培養(yǎng)KCs，采用We

8、stern Blot法對KCs細(xì)胞的TF、TLR4蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測；采用Real-time PCR法對TF mRNA、TLR4 mRNA兩項指標(biāo)進(jìn)行測定；根據(jù)病理切片，對大鼠肝臟和胰腺的病理損傷狀況進(jìn)行觀察。通過免疫組化法對大鼠肝臟、胰腺組織的TF表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：術(shù)后第6h、12h和24h這三個時段，對上述組別內(nèi)大鼠的PT、FIB、APTT、D-D以及WBC值予以測定；3個時間點上，MAP組大鼠的PT、FIB以及APTT

9、等各項指標(biāo)監(jiān)測值，相較于CON組、SO組大鼠均有所增加（P＜0.05），MAP+GdCl3組PT、APTT、FIB、D-D以及WBC值等相較于MAP組均有所下降（P＜0.05）。SAP組大鼠的PT、APTT以及D-D等檢測值，相較于CON組、MAP組以及SO組這三個組別大鼠則有較為顯著地延長（P＜0.01），SAP+GdCl3組大鼠的上述指標(biāo)檢測值相較于SAP組則有顯著地下降（P＜0.01）。但SO組、SO+GdCl3組這兩個組別內(nèi)的大

10、鼠，其PT、FIB、APTT、BAMY、WBC值均較CON組無明顯差別（P＞0.05）。ELISA測得大鼠血清中TF水平，在不同時間點上，MAP組大鼠的TF值相較于CON組、SO組這兩組大鼠，則有顯著地上升（P＜0.05），但MAP+GdCl3組大鼠該指標(biāo)則要顯著低于MAP組大鼠（P＜0.05）。SAP組大鼠的TF值相較于CON組、MAP組以及SO組則有顯著地上升（P＜0.05），SAP+GdCl3組TF值則相較于SAP組大鼠顯著下降（

11、P＜0.05）。SO組和SO+GdCl3組兩組大鼠體內(nèi)，TF值相較于CON組大鼠無明顯差異（P＞0.05）。在不同的時間點上，采用流式細(xì)胞儀對大鼠TF-MPs指標(biāo)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MAP組明顯要高于CON組和SO組大鼠，三組間存在明顯差異性（P＜0.05），和MAP、CON兩組大鼠相比，SAP組有顯著地上升；但相較于MAP大鼠，MAP+GdCl3組大鼠TF-MPs水平顯著下降，組間表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）；和SAP組大鼠相比，SAP

12、+GdCl3組大鼠的TF-MPs值同樣也在下降，存在明顯差異性（P＜0.05）。WB分別檢測6組KCs中6h、12h、24h的TF和TLR4蛋白含量相比較，3個時間點表達(dá)趨勢相同，TF、TLR4兩項指標(biāo)呈現(xiàn)出一致的趨勢，存在明顯差異性（P＜0.05）；通過組間比較：TF、TLR4兩項指標(biāo)上，MAP組大鼠的上升程度上明顯高于SO組和CON組這兩組大鼠（P＜0.05）；CON、CO以及MAP三組大鼠相比，SAP組大鼠的上述兩項指標(biāo)則上升更為

13、顯著（P＜0.05）；相比MAP組，MAP+GdCl3組大鼠的TF、TLR4這兩項指標(biāo)則有顯著地下降（P＜0.05），SAP+GdCl3組大鼠相較于SAP組明顯降低（P＜0.01）。Real-time PCR分別檢測6組KCs中TF mRNA、TLR4 mRNA這兩項指標(biāo)的含量，6h、12h、24h這幾個時間點上，兩者的表達(dá)趨勢較為接近；TLR4 mRNA和TF mRNA在表達(dá)趨勢上則完全相同，差異性較為顯著（P＜0.05）；通過深入地

14、對比：和SO、CON兩組大鼠相比，MAP組大鼠的TF mRNA、TLR4 mRNA這兩項指標(biāo)的表達(dá)的上升程度更為明顯（P＜0.05）；和CON、SO以及MAP三組大鼠相比，SAP組在上述兩項指標(biāo)的表達(dá)水平上則上升更為顯著（P＜0.05），MAP+GdCl3組較MAP組TF mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)量明顯減少（P＜0.05），SAP+GdCl3組TF mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)量較SAP組明顯降低（P＜0.01）。肝臟組織H

15、E染色CON組為正常肝臟結(jié)構(gòu)，SO組有輕微的肝細(xì)胞損害，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。MAP組大鼠體內(nèi)的肝細(xì)胞輕-中度損傷，同時產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)空泡，可見脂肪樣變，炎癥細(xì)胞浸潤；和MAP組大鼠相比，MAP+GdCl3組大鼠的胰腺損傷較輕。SAP組大鼠肝細(xì)胞中至重度損傷，出現(xiàn)在散在的肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞邊界模糊，大量炎癥細(xì)胞浸潤；相較于SAP組大鼠，SAP+GdCl3組胰腺損傷程度相對要輕。根據(jù)胰腺病理切片觀察結(jié)果：MAP組胰腺間質(zhì)水腫，MAP+GdCl3

16、組較MAP組病理損傷有所減輕；SAP組胰腺出現(xiàn)了凝固性壞死現(xiàn)象，同時可觀察到大量炎癥細(xì)胞浸潤；和SAP組大鼠相比，SAP+GdCl3組大鼠的病理損傷程度相對要輕很多。免疫組化結(jié)果顯示：SO組大鼠組織內(nèi)部的TF表達(dá)呈現(xiàn)出弱陽性，MAP組表達(dá)則顯著性上升；相較于SO組、MAP兩組大鼠，SAP組大鼠的TF蛋白有顯著地增加；MAP+GdCl3組比MAP組TF蛋白表達(dá)減弱，而SAP組大鼠TF蛋白表達(dá)則明顯要比SAP+GdCl3組明顯減弱。

17、　　結(jié)論：AP狀態(tài)下，KCs細(xì)胞中的TF、TLR4兩項表達(dá)均明顯上升，TF-MPs的釋放量明顯上升，使得大鼠凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)功能均出現(xiàn)明顯變化；通過對KCs進(jìn)行抑制，有助于下調(diào)AP時TF的表達(dá)量；利用GdCl3對KCs予以阻斷，則可阻斷TLR4通路，使TF表達(dá)明顯下調(diào)，平衡AP初期的微循環(huán)狀態(tài)，對MAP轉(zhuǎn)變?yōu)镾AP起到抑制作用，并最終干擾AP的形成、演變。
　　第三部分、阻斷TLR4信號通路對KCs表達(dá)TF及TF-MPs的調(diào)控<

18、br>　　目的：利用LPS模仿體內(nèi)炎癥刺激，探討KCs在受到LPS刺激時能否釋放出TF-MPs，判斷阻斷TLR4通路能否對KCs表達(dá)TF產(chǎn)生調(diào)控。
　　方法：分為WT組和TLR4-/-組，WT組為野生型C57小鼠所分離培養(yǎng)的KCs，TLR4-/-組為TLR4-/-小鼠所分離培養(yǎng)的KCs，分別加LPS（300ng/ml）刺激，ELISA法檢測各時間點的培養(yǎng)液上清TF濃度，流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)液上清的TF-MPs濃度。Western B

19、lot法檢測KCs中TF和TLR4的蛋白表達(dá)量；利用Real-time PCR法對KCs內(nèi)部的TF mRNA、TLR4 mRNA這兩項指標(biāo)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：在30min-120min的時間點上，WT組小鼠的TF水平均較TLR4-/-組小鼠明顯上升，存在明顯差異性（P＜0.05），WT組：從0min到120min，呈逐漸升高趨勢；TLR4-/-組：0-60min時段中，TF均在顯著性上升；但在60min、120min這

20、兩個時段上無明顯差異性（P＞0.05）。在30min-120min的時間點上，WT組小鼠的TF-MPs指標(biāo)要比TLR4-/-組小鼠有顯著地上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），WT組：從0min到60min，呈逐漸升高趨勢，但60min和120min無明顯差別（P＞0.05），TLR4-/-組：0-60min這個時段中，TF-MPs水平逐漸升高；而60min、120min這兩個時段，則不具有顯著差異（P＞0.05）。WT組TLR4蛋白

21、表達(dá)量從0min到30min，呈逐漸上升狀態(tài)；于30min抵達(dá)該表達(dá)的峰值；在60min、120min這兩個時段上，TLR4指標(biāo)未見明顯差異性（P＞0.05）。TLR4-/-組未檢測到該指標(biāo)的表達(dá)。在不同時間點上，WT組小鼠的TF蛋白表達(dá)要比TLR4-/-組小鼠顯著上升，相比差異性較大（P＜0.05）；WT組：從0min到30min，該指標(biāo)在持續(xù)上升，抵達(dá)峰值的時間為30min，在60min、120min這兩個時段上，其表達(dá)水平較為接近

22、（P＞0.05）。TLR4-/-組：0-30min之間，該指標(biāo)均在持續(xù)上升，抵達(dá)峰值的時間為30min，在60min、120min這兩個時段上，TF蛋白表達(dá)水平未見明顯差異（P＞0.05）。WT組比TLR4-/-組在30min-120min時間點TF mRNA水平均在顯著上升，存在較強(qiáng)的差異性（P＜0.05）；WT組：0-60min時間點上，TF mRNA均在持續(xù)上升，抵達(dá)峰值的時間點為60min；于120min時開始下降。TLR4-/

23、-組：0-60min之間，TF mRNA表達(dá)持續(xù)上升，抵達(dá)峰值的時間點為60min；120min開始降低。0-60min這一時間段，WT組小鼠的TLR4 mRNA表達(dá)不斷上升，于60min抵達(dá)高峰；從120min開始緩慢降低。TLR4-/-組小鼠KCs內(nèi)該指標(biāo)無表達(dá)。
　　結(jié)論：本研究證實敲除TLR4后TF及TF-MPs表達(dá)明顯受到抑制，TLR4與TF及TF-MPs呈正相關(guān)，提示LPS或可利用TLR4這一路徑，對KCs細(xì)胞內(nèi)部的T