人脂肪源干細(xì)胞與纖維蛋白膠共混在裸鼠體內(nèi)外的初步研究.pdf

1、目的：掌握人脂肪源干細(xì)胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs）的分離、培養(yǎng)方法，并探討其部分生物學(xué)特性。探討纖維蛋白膠對(duì)ADSCs增殖的影響。構(gòu)建一種新型可注射型生物支架材料，為臨床修復(fù)軟組織缺損奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：1.取脂肪抽吸術(shù)的脂質(zhì)部分，用酶消化法分離獲得ADSCs。倒置顯微鏡下觀察ADSCs體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)改變。利用MTT法檢測(cè)原代細(xì)胞活性并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；第3代（P3）細(xì)胞分別加入含胰島素

2、、甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、吲哚美辛的條件培養(yǎng)基和含地塞米松、磷酸甘油、維生素C的條件培養(yǎng)基進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化成脂、成骨。油紅O染色、茜素紅染色定性，鏡下觀察ADSCs變化。2.體外培養(yǎng)人ADSCs，取P3細(xì)胞接種到96孔板，以不同濃度（纖維蛋白原與凝血酶比例：4∶1、2∶1、8∶3、5∶2）纖維蛋白膠浸潤(rùn)提取液培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)ADSCs在不同濃度纖維蛋白膠上的增殖情況。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分5組：A組：?jiǎn)渭兝w維蛋白膠組，選用低濃度（

3、纖凝比4:1）纖維蛋白膠；B組：?jiǎn)渭兗兓蟮闹绢w粒組；C組：?jiǎn)渭傾DSCs組，細(xì)胞濃度為3×106/ml；D組：細(xì)胞-脂肪復(fù)合物，細(xì)胞濃度為3×106/ml與純化后的脂肪顆粒1:1混合；E組：細(xì)胞-支架復(fù)合物，細(xì)胞濃度為3×106/ml與纖維蛋白膠1:1混合。每組0.3ml分別注射至裸鼠背部皮下，5點(diǎn)/只，共10只。觀察各組植入后，裸鼠的生命體征及局部變化，8周后取出，分別進(jìn)行體積、濕重測(cè)定、HE染色等分析。
　　結(jié)果：原代細(xì)胞

4、顯示3-4h開始貼壁，最初呈類圓形，2-4d逐漸延伸，呈典型成纖維細(xì)胞。5d左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2-3周單層細(xì)胞融合率可達(dá)90％左右，細(xì)胞排列緊密成旋渦狀。傳代后2-4h開始貼壁，增殖迅速，2-4d即可達(dá)80%。一般3-8代細(xì)胞增殖活躍，之后稍減弱。P3細(xì)胞分化成脂、成骨，油紅O染色鏡下可見細(xì)胞中間有脂滴，茜素紅染色可見橢圓形結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)。不同濃度纖維蛋白膠制備的浸潤(rùn)提取液所培養(yǎng)的ADSCs生長(zhǎng)曲線無明顯差異。本次實(shí)驗(yàn)10只裸鼠，植入復(fù)合

5、物后生命體征平穩(wěn)，注射部位未見明顯炎癥反應(yīng)，B、D、E組均可見新生組織形成，A、C組未見組織。大體觀察，B組和D組可見明顯脂肪顆粒，E組可見新生組織，但略少于B、D組。HE染色B、D、E組均可見脂肪細(xì)胞，D組富含膠原蛋白及脂肪顆粒。體積：D組＞B組＞E組；濕重：D組＞B組＞E組。
　　結(jié)論：構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單有效的體外分離和培養(yǎng)ADSCs的方法，ADSCs生長(zhǎng)旺盛、增殖快，具有多向分化潛能，可以作為組織工程理想的種子細(xì)胞。不同濃度纖維