人脂肪來(lái)源干細(xì)胞復(fù)合聚乙二醇修飾的纖維蛋白凝膠體外構(gòu)建組織工程血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞及組織工程研究的深入進(jìn)行為機(jī)體缺損組織的修復(fù)治療提供新的、有效的途徑和策略。然而目前研發(fā)的組織工程產(chǎn)品在體內(nèi)應(yīng)用研究時(shí)，其厚度都必須小于2毫米。一旦超過(guò)此厚度將直接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣向植入細(xì)胞的輸送，包括組織工程心肌、肝、脂肪以及平滑肌組織的研發(fā)和應(yīng)用，均受限于組織厚度而難以有效發(fā)揮生物學(xué)功能。較大體積(直徑>1厘米)的復(fù)合植入物不僅依靠受體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散，細(xì)胞功能的正常發(fā)揮還必須借助于良好血運(yùn)的支持。構(gòu)建組織工程血管尤其是微血管網(wǎng)

2、成為人工組織、器官產(chǎn)品能否有效發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵問(wèn)題之一。人脂肪干細(xì)胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)已被證實(shí)具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種組織細(xì)胞分化的潛能并初步用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究；纖維蛋白凝膠因其良好的生物相容性被視為組織工程的良好支架材料來(lái)源。本課題研究擬采用聚乙二醇修飾劑優(yōu)化纖維蛋白凝膠特性，將hADSCs與修飾后的纖維蛋白凝膠復(fù)合，觀察體外構(gòu)建組織工程微血管的可行性

3、，為組織器官的體外構(gòu)建及生物學(xué)功能的發(fā)揮提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的: 1、建立并優(yōu)化體外纖維蛋白凝膠復(fù)合hADSCs后向血管內(nèi)皮細(xì)胞(BVEC)誘導(dǎo)分化的技術(shù)方法，并進(jìn)行生物學(xué)性狀鑒定。 2、優(yōu)化PEG對(duì)纖維蛋白原的修飾條件并對(duì)纖維蛋白凝膠相關(guān)特性改變進(jìn)行鑒定。 3、明確聚乙二醇修飾后的纖維蛋白凝膠對(duì)于復(fù)合的hADSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化有無(wú)影響。 研究方法: 1、通過(guò)吸脂手術(shù)得到正

4、常人脂肪組織，經(jīng)膠原酶消化和貼壁培養(yǎng)方法獲得hADSCs。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物檢測(cè)、向脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化等檢測(cè)和分析生物學(xué)特性。 2、取P3代hADSCs，同纖維蛋白原溶液混合后加入凝血酶，制成凝膠。加入血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。按照不同細(xì)胞種植密度和纖維蛋白原濃度分組觀察來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)條件。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)改變，了解其生長(zhǎng)狀態(tài)；HE染色觀察凝膠內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；掃描電鏡和透射電鏡觀察凝膠內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

5、 3、甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基碳酸酯(mPEG—sc)和聚乙二醇琥珀酰亞胺基碳酸酯(sc-PEG—sc)對(duì)于纖維蛋白原的平均修飾度測(cè)定。通過(guò)TNBS法和SDS-PAGE法測(cè)定不同修飾配比度和反應(yīng)溫度下的纖維蛋白原的聚乙二醇化平均修飾度變化。觀察修飾后纖維蛋白凝膠性狀變化，包括：成膠時(shí)間、成膠率、BCA法測(cè)定抗酶降解能力(纖維蛋白溶解酶、膠原酶)及電鏡下凝膠超微結(jié)構(gòu)。 4、取P3代hADSCs，常規(guī)胰酶消化，計(jì)數(shù)后同聚乙二醇修

6、飾后的纖維蛋白原溶液混合后加入凝血酶，制成凝膠。加入血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2天更換一次。通過(guò)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線了解其生長(zhǎng)狀態(tài)；RT-PCR鑒定誘導(dǎo)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、hADSCs呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀排列生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)hADSCs表面標(biāo)志：CD34、CD45(造血干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志)和Flk—1(內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志)表達(dá)陰性；CD29、CD44(粘附分子)、CD90及C

7、D105(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體)，表達(dá)陽(yáng)性CD71(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)僅有微弱表達(dá)。在一定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，可以向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化。 2、在特定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，hADSCs可以向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)后4d開(kāi)始發(fā)生形態(tài)改變，長(zhǎng)梭形細(xì)胞逐漸縮短轉(zhuǎn)為橢園形：誘導(dǎo)第8天細(xì)胞出現(xiàn)多邊形，增殖明顯。誘導(dǎo)第12天細(xì)胞增殖達(dá)到高峰，密度大，局部呈現(xiàn)“鵝卵石”樣排列細(xì)胞。免疫組化和熒光染色證實(shí)有vWF、Flk—1、CD31、CD34、等血管內(nèi)皮細(xì)胞特

8、異性標(biāo)記物表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)第7天的hADSCs表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因包括CD31、CD34和VE—cadherin。 3、纖維蛋白凝膠由纖維蛋白原溶液加入凝血酶作用后形成。其強(qiáng)度同纖維蛋白原濃度呈正相關(guān)。脂肪干細(xì)胞按照不同細(xì)胞密度種植在2mg/ml的纖維蛋白凝膠后向血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)誘導(dǎo)。細(xì)胞在凝膠內(nèi)呈現(xiàn)立體生長(zhǎng)方式，誘導(dǎo)第2天細(xì)胞由梭形條索狀轉(zhuǎn)為星芒狀，誘導(dǎo)第6天開(kāi)始出現(xiàn)相鄰細(xì)胞之間接觸形成管狀結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)第8天

9、細(xì)胞生長(zhǎng)形成明顯管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)第12天管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)密度達(dá)到高峰。隨著種植的細(xì)胞密度增加(0.5～2.0×105/ml)，細(xì)胞形成的立體管網(wǎng)密度明顯增大，而隨著纖維蛋白原濃度增加(2.5mg/ml～10mg/ml)，細(xì)胞形成的立體管網(wǎng)密度逐漸減少。復(fù)合材料經(jīng)HE染色后可見(jiàn)hADSCs立體誘導(dǎo)培養(yǎng)后在凝膠內(nèi)形成的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)掃描電鏡可見(jiàn)纖維蛋白凝膠內(nèi)出現(xiàn)一些血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)所特有的管狀結(jié)構(gòu)。透射電鏡可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特有的Weibl

10、e-Palade小體和細(xì)胞構(gòu)成的管腔樣結(jié)構(gòu)。 經(jīng)TNBS法和SDS-PAGE法測(cè)定，mPEG—sc和sc-PEG—sc對(duì)于纖維蛋白原的平均修飾率隨著修飾劑用量和反應(yīng)溫度上升而逐漸增大。隨著mPEG—sc和sc-PEG—sc用量摩爾配比度的上升，纖維蛋白原成膠率逐漸下降，纖維蛋白原成膠時(shí)間逐步增加，而凝膠的穩(wěn)定性逐漸下降。成膠反應(yīng)溫度升高可減少成膠時(shí)間，但對(duì)于形成的凝膠穩(wěn)定性無(wú)影響。纖維蛋白原在mPEG—sc低配比度條件下(10：

11、1)，纖維蛋白凝膠抗膠原酶降解能力增強(qiáng)，但配比度從25增至100時(shí)，抗膠原酶降解能力逐漸減弱。在sc-PEG—sc配比度10：1、25：1和50：1條件下，纖維蛋白凝膠抗膠原酶降解能力增強(qiáng)，配比度增至100：1時(shí)，抗膠原酶降解能力明顯減弱。不同濃度的纖維蛋白原溶液形成的纖維蛋白凝膠，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)20mg/ml濃度的凝膠內(nèi)纖維蛋白交聯(lián)后形成的支架孔徑小于10mg/ml的凝膠材料。20mg/ml濃度纖維蛋白原溶液經(jīng)mPEG—sc和sc-P

12、EG—sc按照50：1和100：1修飾后發(fā)現(xiàn)相比未修飾的凝膠，支架孔徑逐漸縮小，但是隨著修飾度的上升，材料內(nèi)支架密度下降。同樣配比度修飾條件下50：1，sc-PEG—sc—Fn材料孔徑小于mPEG—sc—Fn材料。 4、通過(guò)生長(zhǎng)曲線觀察到hADSCs在聚乙二醇(mPEG—sc和sc-PEG—sc)修飾后的凝膠內(nèi)增殖速度無(wú)差異，三組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線形態(tài)相似。向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)觀察發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，都出現(xiàn)立體管網(wǎng)狀生長(zhǎng)，管網(wǎng)密度相似

13、，無(wú)明顯差別。RT-PCR顯示誘導(dǎo)5天后纖維蛋白原凝膠組和sc-PEG—sc組表達(dá)CD31、CD34、VE—cadherin和KDR；mPEG—sc修飾組表達(dá)CD31、CD34和KDR。 結(jié)論: 1、hADSCs在體外可穩(wěn)定傳代，并具有多向分化能力。體外經(jīng)誘導(dǎo)后可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，并表達(dá)特異性標(biāo)記。 2、hADSCs同纖維蛋白凝膠復(fù)合后以三維立體方式向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)，在表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記同時(shí)凝膠內(nèi)出現(xiàn)

14、立體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 3、證實(shí)了聚乙二醇修飾劑對(duì)于纖維蛋白原修飾的可行性。優(yōu)化聚乙二醇修飾反應(yīng)條件的同時(shí)，明確了纖維蛋白凝膠生物特性的改變。纖維蛋白凝膠的聚乙二醇化能有效改善纖維蛋白作為細(xì)胞支架材料的生物特性，有利于體外血管構(gòu)建方法的完善和體內(nèi)應(yīng)用研究。 4、聚乙二醇化的纖維蛋白凝膠不影響hADSCs誘導(dǎo)、分化及血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。該方法優(yōu)化了纖維蛋白凝膠作為組織工程微血管構(gòu)建材料的部分功能，為今后完善組織工程微血管