帶血管肌筋膜包埋脂肪干細(xì)胞載體復(fù)合物構(gòu)建血管化組織工程脂肪的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景及目的]： 外傷、感染或腫瘤切除等各種原因造成機(jī)體局部皮膚軟組織的缺損，尤其是顏面部腫瘤或乳腺腫瘤的切除常致整個(gè)器官的缺失。這種器官的缺失及局部軟組織缺損所致的形態(tài)畸形和功能障礙，目前臨床上多以自體組織(皮瓣或肌皮瓣)及人工材料進(jìn)行修復(fù)或充填，盡管這能有效地改善受區(qū)的組織缺損狀況，但它們均存在著許多眾所周知的缺點(diǎn)和不足。例如：自體組織的來(lái)源不足、皮瓣的血供問(wèn)題以及由于供區(qū)損傷帶來(lái)的繼發(fā)性畸形等。因此，其臨床應(yīng)用受到極大的限

2、制。此外，近年來(lái)還有其它多種多樣的方法也被嘗試，包括自體真皮移植，自體脂肪游離移植，膠原注射，人工材料充填等等。然而這些方法的治療效果也不十分理想：例如人工材料的移植排斥反應(yīng)，游離脂肪移植后的吸收問(wèn)題給治療效果帶來(lái)不可預(yù)知性等。盡管修復(fù)軟組織缺損的方法較多，卻難以完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為臨床上更好的解決組織器官缺損等難題提供了一個(gè)全新的思路。 組織工程技術(shù)能以少量種子細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料復(fù)合植入體內(nèi)，修復(fù)

3、較大的組織或器官缺損，重建生理功能，為真正實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開(kāi)辟了全新的途徑。組織工程學(xué)的發(fā)展需要幾個(gè)必備的因素，即：(1)可獲得的種子細(xì)胞，并能控制其生長(zhǎng)和組織形成；(2)結(jié)構(gòu)精確的三維支架，以適合再造需要的組織量和形狀，而且與細(xì)胞具有良好的生物相容性；(3)適宜的微環(huán)境，能提供充分的血供和營(yíng)養(yǎng)，維持細(xì)胞增殖和功能。 目前已證實(shí)脂肪組織中存在類似骨髓基質(zhì)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞，且被命名為脂肪組

4、織來(lái)源的干細(xì)胞(Adipose-deriredstemcells，ADSCs)。這種干細(xì)胞經(jīng)證實(shí)同樣具有體內(nèi)外多向分化潛能，如能向成熟脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及心肌細(xì)胞定向轉(zhuǎn)化，對(duì)多種組織的損傷具有良好的修復(fù)作用，而且取材方便，獲取量大，不易造成供區(qū)繼發(fā)畸形等，有望成為組織工程研究中的重要種子細(xì)胞。 本課題研究了成年兔ADSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化能力，同時(shí)判斷ADSCs與海綿狀I(lǐng)型膠原

5、支架復(fù)合后的生物相容性；進(jìn)而采用BrdU標(biāo)記的ADCSs作為種子細(xì)胞，以海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白為支架，通過(guò)觀察帶血管肌筋膜包裹方法對(duì)移植物種子細(xì)胞的成活作用影響，以探討ADSCs-載體復(fù)合物在體內(nèi)成脂效應(yīng)的理想途徑和構(gòu)建工程化、血管化的脂肪組織的適宜方法，為臨床上自體脂肪組織移植修復(fù)軟組織缺損及脂肪干細(xì)胞的有效移植提供理論依據(jù)。 [材料與方法]： 1、成年兔脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的分離培養(yǎng)與鑒定 切取成年兔腹股溝皮

6、下脂肪墊，使用酶消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化，細(xì)胞傳至第3代供實(shí)驗(yàn)使用。采用細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞表面與干細(xì)胞相關(guān)的部分分子如CD29、CD34、CD44及CD49d，確定細(xì)胞類型：同時(shí)在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并分別以油紅O染色、茜素紅染色及阿利辛藍(lán)染色進(jìn)行定性鑒定。 2、BrdU體外脂肪干細(xì)胞標(biāo)記及觀察標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響 BrdU體外標(biāo)記第3代AD

7、SCs，取P3代細(xì)胞以終濃度分別為5、10、15和20μmol／L的BrdU進(jìn)行標(biāo)記，分別記為A、B、C、D組；另一組不含BrdU，作為空白對(duì)照組E。標(biāo)記12、24、48和72h后，采用免疫熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記率，以確定BrdU的最佳標(biāo)記濃度及最佳標(biāo)記時(shí)間；相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及傳代后細(xì)胞標(biāo)記率的變化；檢測(cè)ADSCs標(biāo)記后向脂肪細(xì)胞分化的能力；使用MTT比色分析法檢測(cè)標(biāo)記后細(xì)胞的增殖及毒性情況。 3、

8、成年兔ADSCs與海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白生物相容性的檢測(cè) 將標(biāo)記后的P3代ADSCs與I型膠原蛋白海綿支架體外聯(lián)合培養(yǎng)，采用兩種不同的混合方法(細(xì)胞直接滴加于支架表面法和細(xì)胞注射于支架內(nèi)部法)，測(cè)定細(xì)胞在支架上的黏附率，相差顯微鏡及電子顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在支架上黏附、伸展、生長(zhǎng)和增殖情況；檢測(cè)ADSCs與支架復(fù)合后向脂肪細(xì)胞分化的能力；使用MTT比色分析法檢測(cè)接種在支架的細(xì)胞的增殖情況。 4、帶血管肌筋膜包埋ADSCs-載體

9、復(fù)合物構(gòu)建血管化組織工程脂肪的體內(nèi)研究 經(jīng)解剖分離成年兔兩側(cè)背闊肌肌皮瓣，分離形成帶血管蒂的肌筋膜囊，分別包裹成脂誘導(dǎo)前、后的ADSCs與I型膠原蛋白載體復(fù)合物(A組，n=10和B組，n=10)，另將同樣大小的復(fù)合物植入同一動(dòng)物右側(cè)臀大肌肌筋膜囊(無(wú)血管蒂)作為對(duì)照組(C組，n=10)；而空支架組(D組)即不含細(xì)胞成份的空支架植入兔左側(cè)臀大肌肌筋膜囊，各組實(shí)驗(yàn)均采用自身對(duì)照。術(shù)后8w取材，經(jīng)油紅O染色、HE染色和免疫組織熒光染色

10、確定新生組織的性質(zhì)；測(cè)定三組新生組織的濕重和微血管密度，分析評(píng)價(jià)帶血管肌筋膜包裹方法對(duì)促進(jìn)移植物血管化與種子細(xì)胞成活的影響。 [結(jié)果]： 1.原代培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖及多向分化能力。分別在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基及軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下，能分化出成熟的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；分別以油紅O染色、茜素紅染色及阿利辛藍(lán)染色呈陽(yáng)性。免疫熒光檢測(cè)到細(xì)胞表面抗原分子

11、CD29、CD44、CD49d表達(dá)呈陽(yáng)性。 2.第3代ADSCs經(jīng)BrdU標(biāo)記后進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下胞核呈綠色熒光?？偟目磥?lái)，隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)和BrdU劑量的增加，標(biāo)記率逐漸增高，BrdU終濃度為15μmol／L且標(biāo)記48h后細(xì)胞標(biāo)記率>90％，但標(biāo)記時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)和8rdU濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞標(biāo)記率無(wú)明顯增高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明BrdU標(biāo)記ADSCs的最佳終濃度為15μmol/L，最佳標(biāo)記時(shí)間為48h。與正常未標(biāo)記細(xì)胞比

12、較，標(biāo)記后細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)增殖狀況無(wú)明顯差別，活細(xì)胞數(shù)>98％。細(xì)胞標(biāo)記后不影響向脂肪細(xì)胞分化的能力。 3.ADSCs可以在海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白支架上生長(zhǎng)并逐漸黏附，細(xì)胞未經(jīng)成脂誘導(dǎo)前，ADSCs與支架的混合方式不同，細(xì)胞在支架上的黏附率也不同：ADSCs在支架表面滴加組(A組，n=6)的細(xì)胞黏附率為79.5％±2.5％；ADSCs在支架內(nèi)部注射組(B組，n=6)的細(xì)胞黏附率92.7％±2.2％，A、B兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較差

13、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.965，P=0.002)。而ADSCs成脂誘導(dǎo)后注射于支架內(nèi)部的黏附率為91.3％±1.5％(C組，n=6)，B、C兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.889，P=0.424)。ADSCs與支架混合培養(yǎng)后不影響細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖狀況，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性反應(yīng)；細(xì)胞與支架復(fù)合后不影響向脂肪細(xì)胞分化的能力。 4.術(shù)后8W取材發(fā)現(xiàn)，A、B、C三組于移植物包埋區(qū)均可觀察到新生組織形成；空白對(duì)照組(D組)

14、未見(jiàn)新生組織形成。A組(n=10)新生組織平均濕重為0.0230g±0.0016g；B組(n=10)新生組織平均濕重為0.0251g±0.0019g；C組(n=10)新生組織平均濕重為0.0202g±0.0014g，A組與B組、B組與C組及A組與C組之間濕重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。HE染色及油紅O染色均證實(shí)新生組織為成熟脂肪組織，膠原支架已完全吸收降解；免疫熒光染色陽(yáng)性證實(shí)新生組織為外源性。各組新生微血管密度分別為：A

15、組(n=10)28.5±3.7：B組(n=10)31.2±4.5；C組(n=10)19.3±2.6；A與C，B與C之間新生微血管密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。 [結(jié)論]： 1、本實(shí)驗(yàn)成功地從成年兔皮下脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪干細(xì)胞(ADSCs)。建立了一整套有關(guān)ADSCs分離、培養(yǎng)和鑒定的較簡(jiǎn)便的方法。ADSCs具有很強(qiáng)的增殖和自我更新能力。ADSCs具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能。ADSC

16、s來(lái)源豐富、取材容易，創(chuàng)傷小，是理想的組織工程種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。 2、BrdU標(biāo)h3ADSCs的最佳時(shí)間為48小時(shí)；最佳終濃度為15μmol／L；標(biāo)記陽(yáng)性率>90％。BrdU對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，安全性高，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及成脂分化無(wú)明顯影響。 3、ADSCs可以在海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白支架上逐漸黏附，細(xì)胞黏附率高，生長(zhǎng)、增殖良好。支架對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性反應(yīng)。膠原蛋白材料與ADSCs之間具有良好的生物相容性。 4、