脂肪干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和構(gòu)建組織工程化周?chē)窠?jīng).pdf

1、[目的]:周?chē)窠?jīng)損傷及損傷后導(dǎo)致的神經(jīng)缺損，是臨床常見(jiàn)的致殘性疾病。自體神經(jīng)移植修復(fù)神經(jīng)缺損的效果較好，但會(huì)造成新的神經(jīng)損傷，而且所供移植的多為細(xì)小的皮神經(jīng)，來(lái)源有限，不能滿(mǎn)足長(zhǎng)段或粗大神經(jīng)主干修復(fù)的需要。異體神經(jīng)移植每因免疫排斥而失敗。因此迫切需要尋求其他組織或材料作為移植物。組織工程化周?chē)窠?jīng)的研制為周?chē)窠?jīng)的修復(fù)帶來(lái)新的希望。許旺細(xì)胞是周?chē)窠?jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，在周?chē)窠?jīng)的發(fā)育和再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，許多研究表明在周?chē)窠?jīng)多種

2、移植體內(nèi)加入許旺細(xì)胞可促進(jìn)軸突再生。但許旺細(xì)胞在涉及臨床應(yīng)用時(shí)遇到許多困難，如自體源性許旺細(xì)胞需犧牲相對(duì)次要的神經(jīng)、許旺細(xì)胞體外增殖能力差和難以獲得足夠的數(shù)量。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可在體內(nèi)外分化為許旺細(xì)胞，本課題組已將許旺細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或分化的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與聚乳酸.羥基乙酸共聚物和去細(xì)胞神經(jīng)兩種支架構(gòu)建大鼠和獼猴的組織工程化周?chē)窠?jīng)并成功修復(fù)神經(jīng)缺損。脂肪干細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在來(lái)源、細(xì)胞群特點(diǎn)和分化潛能等多方面極為相似，但脂肪干細(xì)胞

3、可從皮下脂肪組織中分離得到，不需要抽取骨髓，對(duì)患者損傷小，且容易獲得足夠的數(shù)量，因而具有更大的臨床實(shí)用價(jià)值。為了探討脂肪干細(xì)胞用作組織工程化周?chē)窠?jīng)種子細(xì)胞新來(lái)源的可行性，本研究將脂肪干細(xì)胞定向分化為許旺細(xì)胞，然后與去細(xì)胞神經(jīng)支架構(gòu)建組織工程化周?chē)窠?jīng)修復(fù)大鼠15mm長(zhǎng)坐骨神經(jīng)損傷并觀察其修復(fù)效果。 [方法]: 1.脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究1.1體外分離培養(yǎng)取4周齡左右的近交系F344大鼠的腹股溝脂肪墊，采用膠原酶消化

4、、離心、篩網(wǎng)過(guò)濾和貼壁等步驟分離脂肪干細(xì)胞，傳代、純化并擴(kuò)增。 1.2生長(zhǎng)曲線測(cè)定取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第1、5、10代細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，離心，棄上清，重懸，按0.4×104/孔接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)，每24h取細(xì)胞，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。 1.3表面標(biāo)志測(cè)定取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心，PBS洗3次，向收獲的細(xì)胞中加熒光標(biāo)記的CD11b、CD29、CD44、CD45、CD

5、49d、CD54、CD80、CD86、MHCI和MHCII抗體，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)。 1.4向成骨細(xì)胞分化取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞融合達(dá)80％的的第3代細(xì)胞，PBS洗3次，加入含地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，第20天茜素紅S法染色鑒定成骨細(xì)胞。 1.5向脂肪細(xì)胞分化取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞完全融合的第3代細(xì)胞，PBS洗3次，加入含地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、牛胰

6、島素和吲哚美辛的脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液，第20天油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞。 1.6核型分析取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3、10代細(xì)胞，加入秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)4h，采集分裂細(xì)胞，制作染色體標(biāo)本，染色體計(jì)數(shù)并進(jìn)行核型分析。 1.7體外標(biāo)記取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，傳代后加入5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，進(jìn)行免疫熒光染色，計(jì)算BrdU標(biāo)記率。 2.脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為類(lèi)許旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究. 3.去細(xì)胞神

7、經(jīng)種植脂肪干細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究3.1去細(xì)胞神經(jīng)的制備取F344大鼠坐骨神經(jīng)，剝除神經(jīng)周?chē)Y(jié)締組織，依次用蒸餾水、3％TritonX-100和4％脫氧膽酸鈉處理去除細(xì)胞，然后進(jìn)行HE染色、掃描電鏡和透射電鏡檢測(cè)。 3.2脂肪干細(xì)胞的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染用攜帶綠色熒光蛋白基因的復(fù)制缺陷性重組腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染第3代脂肪干細(xì)胞，Hoechst33342復(fù)染核后熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性率。

8、 3.3脂肪干細(xì)胞與去細(xì)胞神經(jīng)的體外復(fù)合培養(yǎng)將轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的脂肪干細(xì)胞懸液顯微注入去細(xì)胞神經(jīng)構(gòu)建組織工程化周?chē)窠?jīng)，繼續(xù)培養(yǎng)。然后進(jìn)行熒光顯微鏡、透射電鏡和HE染色檢測(cè)，觀察脂肪干細(xì)胞在去細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)的生長(zhǎng)情況。 4.種植脂肪干細(xì)胞的去細(xì)胞神經(jīng)修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究4.1外科手術(shù)取雌性F344成年大鼠48只，重200～220g。在無(wú)菌條件下切除右側(cè)坐骨神經(jīng)，造成15mm的神經(jīng)缺損。隨機(jī)分成6組，每組8只，分別用6種不同

9、的實(shí)驗(yàn)組修復(fù)：脂肪干細(xì)胞+去細(xì)胞神經(jīng)；誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞+去細(xì)胞神經(jīng)；許旺細(xì)胞+去細(xì)胞神經(jīng)；去細(xì)胞神經(jīng)；自體坐骨神經(jīng)；空白對(duì)照。 4.2神經(jīng)電生理檢測(cè)術(shù)后12周對(duì)神經(jīng)移植體進(jìn)行神經(jīng)電生理檢測(cè)，測(cè)定神經(jīng)動(dòng)作電位的刺激閾強(qiáng)度和最大振幅并計(jì)算傳導(dǎo)速度。 4.3熒光金逆行示蹤神經(jīng)電生理檢測(cè)后，在橋接遠(yuǎn)端下約10mm處的坐骨神經(jīng)干注入熒光金溶液，繼續(xù)飼養(yǎng)3天，灌注固定后取腰部脊髓，冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察。 4.4組織

10、學(xué)檢測(cè)大鼠灌注固定后同時(shí)取神經(jīng)移植體，移植體遠(yuǎn)段的組織學(xué)切片進(jìn)行HE染色、S-100和神經(jīng)微絲蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色；移植體中段的組織學(xué)切片進(jìn)行透射電鏡觀察、甲苯胺藍(lán)染色并作圖象分析，測(cè)量神經(jīng)組織百分比、有髓神經(jīng)纖維密度、軸突直徑和髓鞘厚度。 4.5術(shù)后坐骨功能指數(shù)測(cè)定在術(shù)前及術(shù)后2、4、8和12周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的步態(tài)分析，測(cè)定坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，繪制曲線圖。 [結(jié)果]: 1.脂肪干細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，第10代以前

11、的脂肪干細(xì)胞有較強(qiáng)的活力和增殖能力，體外培養(yǎng)至第10代，其細(xì)胞仍穩(wěn)定為二倍體核型。BrdU可標(biāo)記其核，陽(yáng)性率在95％以上。 2.脂肪干細(xì)胞CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表達(dá)陰性，MHCI、MHCII表達(dá)弱陽(yáng)性，CD29、CD44、CD54的表達(dá)陽(yáng)性。在合適誘導(dǎo)液的作用下，脂肪干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。 3.多種因子依次聯(lián)合誘導(dǎo)后，脂肪干細(xì)胞的形態(tài)改變，胞體呈橢圓形，有2～3個(gè)纖細(xì)的細(xì)胞突起。

12、Western印跡顯示誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞同時(shí)表達(dá)S-100和GFAP這兩種許旺細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。雙重免疫熒光染色顯示S-100和GFAP的最高表達(dá)率分別為(78.08±6.08)％和(72.38±6.43)％，雙重表達(dá)率為(69.76±6.43)％。 4.Ad-GFP轉(zhuǎn)染后，約85％的脂肪干細(xì)胞可激發(fā)出綠色熒光。化學(xué)萃取可有效去除神經(jīng)纖維中的細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞可在去細(xì)胞神經(jīng)支架內(nèi)生長(zhǎng)并遷移。 5.術(shù)后12周，去細(xì)胞神經(jīng)組的刺

13、激閾強(qiáng)度高于自體神經(jīng)組；去細(xì)胞神經(jīng)組動(dòng)作電位的最大振幅和神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯分別低于脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和自體神經(jīng)組。脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和自體神經(jīng)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。空白對(duì)照組的神經(jīng)缺損處未見(jiàn)橋接物，故未進(jìn)行該項(xiàng)試驗(yàn)。 6.注入熒光金后3d，在一個(gè)脊髓橫切面中，脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組、去細(xì)胞神經(jīng)組和自體神經(jīng)組最多可分別見(jiàn)到4、5、5、2和8個(gè)被熒光金標(biāo)記的陽(yáng)性神經(jīng)

14、元胞體。 7.術(shù)后12周，去細(xì)胞神經(jīng)組神經(jīng)移植體遠(yuǎn)段S-100蛋白和神經(jīng)微絲蛋白免疫組化染色見(jiàn)有少量的陽(yáng)性染色許旺細(xì)胞和神經(jīng)纖維且排列雜亂，而在脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和自體神經(jīng)組中，可見(jiàn)大量陽(yáng)性染色的許旺細(xì)胞和神經(jīng)纖維，神經(jīng)纖維排列整齊、規(guī)則。 8.術(shù)后12周，組織學(xué)圖象分析顯示神經(jīng)移植體中段去細(xì)胞神經(jīng)組的神經(jīng)組織百分比、有髓神經(jīng)纖維密度、軸突直徑都小于脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和

15、自體神經(jīng)組；去細(xì)胞神經(jīng)組的髓鞘厚度小于自體神經(jīng)組。脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和自體神經(jīng)組的各項(xiàng)指標(biāo)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 9.步態(tài)分析結(jié)果表明，各組間在術(shù)后2和4周時(shí)的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)沒(méi)有明顯差別。術(shù)后8周，空白對(duì)照組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)小于自體神經(jīng)組。術(shù)后12周，自體神經(jīng)組有最高的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，而空白對(duì)照組有最低的數(shù)值。空白對(duì)照組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)小于脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和自體神經(jīng)組；去

16、細(xì)胞神經(jīng)組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)也明顯小于上述四組。但在脂肪干細(xì)胞組、誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞組、許旺細(xì)胞組和自體神經(jīng)組之間以及空白對(duì)照組和去細(xì)胞神經(jīng)組之間，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)無(wú)明顯差異。 [結(jié)論]: 1.采用膠原酶消化、離心、篩網(wǎng)過(guò)濾和貼壁篩選等步驟，可從大鼠腹股溝脂肪墊獲得大量的脂肪干細(xì)胞，短期內(nèi)經(jīng)傳代后可提高細(xì)胞純度和數(shù)量，具有較強(qiáng)的增殖能力和良好的分化能力，表達(dá)特異的表面分子。 2.采用β-巰基乙醇、全反式

17、視黃酸、Forskolin、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子和Heregulin-β可以誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞在體外分化為類(lèi)許旺細(xì)胞。 3.化學(xué)萃取可有效去除神經(jīng)纖維中的細(xì)胞。顯微注入的脂肪干細(xì)胞可在去細(xì)胞神經(jīng)支架中良好生長(zhǎng)并遷移存活。 4.脂肪干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與去細(xì)胞神經(jīng)支架構(gòu)建的組織工程化周?chē)窠?jīng)移植體，能夠促進(jìn)神經(jīng)再生并修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損，其修復(fù)效果接近于自體神經(jīng)移植，具有廣闊的臨床應(yīng)用