成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合肌瓣構(gòu)建血管化組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在口腔頜面外科中，創(chuàng)傷及腫瘤等疾患常引起的軟組織、骨組織的缺損，如何恢復(fù)缺損區(qū)的外形及功能，恢復(fù)患者的生活質(zhì)量，一直是臨床上的難題之一，長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的相關(guān)基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐。目前能夠應(yīng)用于臨床的修復(fù)方法主要還是應(yīng)用自體骨移植修復(fù)，但這將使患者承受開(kāi)辟第二手術(shù)區(qū)的痛苦，而且存在移植骨塑形難以與缺損骨形態(tài)一致等問(wèn)題。 近年來(lái)隨著細(xì)胞生物學(xué)及生物材料學(xué)的發(fā)展，組織工程學(xué)得到了快速發(fā)展，利用組織工程學(xué)方法和手段修復(fù)骨缺損

2、是一種全新的骨修復(fù)模式。組織工程技術(shù)可以通過(guò)獲取少量的組織細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后與支架復(fù)合，構(gòu)建與病損區(qū)性狀結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性相近的細(xì)胞-支架復(fù)合體，以修復(fù)缺損組織。但在構(gòu)建組織工程骨體內(nèi)移植修復(fù)缺損時(shí)，必須保持植入體內(nèi)的細(xì)胞成活并發(fā)揮功能。因此，在體內(nèi)、體外預(yù)構(gòu)一個(gè)有良好血液供應(yīng)的組織工程骨瓣，從而保證細(xì)胞支架復(fù)合物的功能發(fā)揮至關(guān)重要。本研究在以下方面對(duì)血管化組織工程骨進(jìn)行了初步研究：成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞體外聯(lián)合共培養(yǎng)以觀察兩種細(xì)胞相

3、互功能的影響；將兩種細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合背闊肌瓣預(yù)構(gòu)血管化組織工程骨；應(yīng)用血管化組織工程骨修復(fù)兔下頜骨非連續(xù)性缺損。本研究分為五部分： 論文一兔成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定目的：在體外培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞并鑒定。方法：取出生24h日本大耳白兔四肢長(zhǎng)骨作為成骨細(xì)胞來(lái)源，腎皮質(zhì)微血管為血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源，進(jìn)行原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、應(yīng)用堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)染色鑒定成骨細(xì)胞、Ⅷ因子免疫組化染色鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果：體外培養(yǎng)的成

4、骨細(xì)胞磷酸酶染色陽(yáng)性、鈣結(jié)節(jié)染色為棕黑色鈣鹽沉積。血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，Ⅷ因子免疫組化染色陽(yáng)性，兩種細(xì)胞均可達(dá)到95％以上陽(yáng)性率。結(jié)論：兔成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，仍然保持自我增殖能力及各自功能。 論文二外消旋聚乳酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響目的：通過(guò)觀察外消旋聚乳酸(PDLLA)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，以確定其是否可作為組織工程的細(xì)胞支架材料。方法：兩周齡日本大耳白兔(解放軍總醫(yī)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供)，無(wú)菌條件下取腎

5、皮質(zhì)，1：250胰蛋白酶和1：100Ⅱ型膠原酶1：1混合37℃消化30min，離心(1000r/min)10min。取沉淀加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成血管內(nèi)皮細(xì)胞混懸液，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中，72h換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代。將PDLLA浸于75％酒精4h，蒸餾水48h。1gPDLLA浸入含0.1％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基15ml中，放入37℃、5％二氧化碳孵箱中，7d。吸出浸提液，設(shè)浸提原液組、1/2液組。無(wú)菌封存于4

6、℃冰箱中備用。將消毒好的支架材料置于24孔培養(yǎng)皿中，將血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于支架上，37℃、5％二氧化碳孵箱孵育。于第10d將復(fù)合細(xì)胞的支架材料掃描電鏡觀察。將第3代血管內(nèi)皮細(xì)胞按1×103濃度接種于96孔培養(yǎng)皿中，分別加入新配制的培養(yǎng)基、浸提原液組、1/2液組。分別于1，3,5,7dMTT法測(cè)光吸收值，檢測(cè)細(xì)胞活力。再通過(guò)下列計(jì)算公式相對(duì)增殖率(RGR)=實(shí)驗(yàn)組吸光值/陰性組對(duì)照組吸光值×100％。根據(jù)RGR值評(píng)定毒性程度；RGR值≥10

7、0％為0級(jí)，75％-99％為Ⅰ級(jí)，50％-74％為Ⅱ級(jí)，25％-49％為Ⅲ級(jí)，1％-24％為Ⅳ級(jí)，0為Ⅴ級(jí)。結(jié)果：細(xì)胞接種于支架后第10d掃描電鏡觀察可見(jiàn)，細(xì)胞吸附于材料表面，形態(tài)多樣，有多個(gè)突起，細(xì)胞跨越微孔表面或向孔內(nèi)張入，細(xì)胞間突起相連。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示支架浸提液對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響，原液組與浸提液組細(xì)胞活性無(wú)明顯差異(P＞0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)PDLLA浸提液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞1、3、5、7d后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。根據(jù)ISO和醫(yī)學(xué)

8、材料生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞相對(duì)增殖率表明材料毒性分級(jí)為0或1級(jí)，說(shuō)明材料無(wú)細(xì)胞毒性，均為合格。4結(jié)論：血管內(nèi)皮細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)狀態(tài)良好并可分泌細(xì)胞基質(zhì)，PDLLA無(wú)細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。 論文三共培養(yǎng)下成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互功能影響及形態(tài)學(xué)觀察目的：觀察共培養(yǎng)下成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互功能影響及形態(tài)學(xué)觀察。方法：首先將成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞以1：0、1：1、2：1、4：1聯(lián)合直接共培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，另將成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮

9、細(xì)胞以0：1、1：1、2：1、4：1聯(lián)合直接共培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上。將四組細(xì)胞分別培養(yǎng)3d、6d、9d，0.25％胰酶消化各組細(xì)胞并收集，超聲波破碎細(xì)胞，共四次間隔10s，4000轉(zhuǎn)/分離心10min，收集上清液、按ALP試劑盒說(shuō)明測(cè)定光吸收值并計(jì)算各組細(xì)胞的ALP含量。另將四組細(xì)胞分別培養(yǎng)3d、6d、9d，收集各組6孔培養(yǎng)基應(yīng)用骨鈣素放免試劑盒測(cè)定上清液中的骨鈣素的含量。將聯(lián)合直接共培養(yǎng)的兩種細(xì)胞分別于培養(yǎng)后的1d、3d、5d、7

10、d取出蓋玻片，Ⅷ因子免疫組化組化染色后計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：在共培養(yǎng)初期各實(shí)驗(yàn)組ROB及RVEC保持各自細(xì)胞形態(tài)，隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至第9天時(shí)，兩種細(xì)胞失去各自細(xì)胞形態(tài)均呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，但未出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。在兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞比例為2：1組堿性磷酸酶活性測(cè)定、骨鈣素含量明顯高于其他兩實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，而與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05)。各組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中在共培養(yǎng)第一天

11、，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量無(wú)差異(P＞0.05)。從共培養(yǎng)第三天起至第七天，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組3細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組有差異(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組無(wú)明顯差異而與其他兩實(shí)驗(yàn)組有顯著差異。4結(jié)論：在成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)中，兩種細(xì)胞無(wú)抑制現(xiàn)象，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)比例為2：1時(shí)細(xì)胞功能促進(jìn)明顯，可以用于血管化組織工程骨的構(gòu)建。 論文四成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合肌瓣預(yù)構(gòu)血管化骨的初步研究目的：目的：探討將成骨細(xì)胞與血管

12、內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合肌瓣預(yù)構(gòu)血管化組織工程骨的可能性，及血管化與成骨的關(guān)系。方法：制作體積為2.5×1×1cmPDLLA支架并用Ⅰ型膠原包埋備用。取乳兔(24h)四肢長(zhǎng)骨原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞，腎皮質(zhì)原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并將傳代后的成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存、復(fù)蘇處理。9只實(shí)驗(yàn)兔分3組，A組左側(cè)背闊肌植入ROB與RVEC比例為2：1細(xì)胞支架復(fù)合體，右側(cè)植入ROB/PDLLA；B組左側(cè)為ROB+RVEC/PDLLA、右側(cè)為PDLLA；C組

13、左側(cè)為ROB/PDLLA、右側(cè)PDLLA。2周、4周、8周后處死動(dòng)物大體觀察植入材料變化，HE染色鏡下觀察體內(nèi)成骨與血管化情況，以及血管化與成骨之間關(guān)系。結(jié)果：大體觀察可見(jiàn)4周、8周時(shí)三組植入物體積減小，PDLLA植入組成有纖維組織并可見(jiàn)部分區(qū)域有毛細(xì)血管長(zhǎng)入。PDLLA/ROB、PDLLA/ROB+RVEC組植入物表面均由含大量毛細(xì)血管肌纖維長(zhǎng)入。對(duì)于植入物同期標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組硬度明顯高于PDLLA組，且隨時(shí)間延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組硬度呈現(xiàn)明

14、顯遞增趨勢(shì)。單純PDLLA組植入后2周、4周、8周均未見(jiàn)骨組織形成，可見(jiàn)PDLLA降解，體積減小。ROB/PDLLA組植入4周起可見(jiàn)骨組織形成，材料周?chē)梢?jiàn)有小血管長(zhǎng)入，隨時(shí)間延長(zhǎng)成骨量及血管化程度均有所增加。ROB+RVEC/PDLLA組可見(jiàn)在支架內(nèi)部有大量毛細(xì)血管形成，支架周?chē)晒羌?xì)胞活躍，成骨能力較強(qiáng)，在體內(nèi)成骨能力及血管化程度均高于單純成骨細(xì)胞復(fù)合支架組。結(jié)論：將兩種細(xì)胞復(fù)合支架后與背闊肌皮瓣聯(lián)合應(yīng)用可預(yù)構(gòu)血管化骨瓣，且成骨能力

15、與血管化程度均很理想。 論文五血管化組織工程骨復(fù)合體修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究目的：本實(shí)驗(yàn)旨在將成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)并構(gòu)建支架復(fù)合體以血管化組織工程骨方式修復(fù)兔下頜骨非連續(xù)性缺損。方法：體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)凍存、復(fù)蘇、擴(kuò)增后備用。將PDLLA制成15×10×7mm3，Ⅰ型膠原修飾、環(huán)氧乙烷消毒備用。將成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞以2：1比例滴加到支架上，體外培養(yǎng)10天。本實(shí)驗(yàn)共用12只日本大耳白兔建立兔雙側(cè)

16、下頜骨缺損非連續(xù)性缺損模型，手術(shù)切除兔下頜骨體部1.5cm骨塊，保留上頜骨上緣。實(shí)驗(yàn)分為三組，A組成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合PDLLA，B組單純成骨細(xì)胞復(fù)合PDLLA，C組單純PDLLA組。1～6號(hào)兔左側(cè)下頜骨缺損處植入A組，右側(cè)植入B組；7～9號(hào)兔左側(cè)下頜骨缺損處植入C組，右側(cè)植入A組；10～12號(hào)兔左側(cè)下頜骨缺損處植入B組，右側(cè)植入C組。手術(shù)后4周、8周通過(guò)大體標(biāo)本、形態(tài)學(xué)、X-射線觀察骨缺損修復(fù)情況，修復(fù)區(qū)骨血管化情況等。結(jié)果：大

17、體觀察，8周時(shí)C組缺損處仍無(wú)明顯修復(fù)，材料質(zhì)地較軟，無(wú)骨組織形成。A組，8周時(shí)缺損處已大部分為骨組織修復(fù)，B組缺損修復(fù)范圍小于A組。形態(tài)學(xué)觀察，A組修復(fù)側(cè)血管周?chē)行律浌墙M織形成，同時(shí)可見(jiàn)膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨兩種成骨方式。在材料中心區(qū)可見(jiàn)有血管形成，越靠近血管成骨越多。B組修復(fù)側(cè)可見(jiàn)新骨形成，血管自周?chē)M織長(zhǎng)入，故材料周?chē)梢?jiàn)毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，材料中央血管化程度不高。C組材料修復(fù)側(cè)，材料內(nèi)充滿纖維結(jié)締組織，無(wú)明顯骨組織形成。X-射線觀察，