兔骨髓單個核細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞促組織工程骨支架血管化研究.pdf

1、組織工程技術(shù)為解決大段骨缺損治療中移植骨來源的難題帶來了希望。骨組織工程研究在種子細胞、支架材料、細胞因子、培養(yǎng)條件等方面已取得階段性成果，但目前構(gòu)建的組織工程骨因缺乏有效的早期快速血管化措施，植入體內(nèi)后種子細胞不能及時獲得足夠的氧和營養(yǎng)，從而導(dǎo)致再生組織生長速度過慢、新生組織質(zhì)量缺陷，因此，組織工程化骨的快速血管化問題成為當(dāng)前的研究重點。研究表明，從骨髓分離、獲取的單個核細胞在體外適宜的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)后能表達血管內(nèi)皮細胞表型。這種由骨

2、髓單個核細胞體外誘導(dǎo)而來的血管內(nèi)皮細胞，在一定條件下可以促進組織的血管生成。脫鈣骨基質(zhì)由于具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性和力學(xué)性能，是目前骨組織工程較為理想的支架材料，已用于骨組織工程實驗研究及臨床?；谏鲜龇治觯狙芯繑M對骨髓單個核細胞進行分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)，以獲取足量具有血管內(nèi)皮細胞表型的細胞；然后，采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)將其接種到脫鈣骨基質(zhì)支架上，并進行體外培養(yǎng)使其預(yù)先血管化；進一步將體外血管化的細胞-支架復(fù)合體移植入動物

3、大段骨缺損區(qū)域進行原位觀察，通過影像學(xué)及組織化學(xué)等相關(guān)方法檢測上述體外血管化的工程化骨支架的在體血管生成能力。 目的： 1．分離、獲取兔骨髓單個核細胞，條件培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)使其具有血管內(nèi)皮表型；科學(xué)的計量分析并觀察其體外培養(yǎng)的主要生物學(xué)特點，獲取足量具備血管發(fā)生功能的血管內(nèi)皮細胞； 2．采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)構(gòu)建兔骨髓單個核細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞及脫鈣骨基質(zhì)支架復(fù)合物，體外培養(yǎng)使其預(yù)先血管化，同時觀察纖維蛋白凝膠對骨

4、髓來源的內(nèi)皮細胞分裂、增殖的影響； 3．將體外制備并預(yù)先血管化的細胞-支架復(fù)合體自體移植到兔尺骨大段骨缺損區(qū)域，在體觀察其成血管能力。 方法： 1．兔骨髓經(jīng)梯度離心后分離獲得單個核細胞，采用特定誘導(dǎo)培養(yǎng)液(EGM-2培養(yǎng)液)促使原代培養(yǎng)細胞向血管內(nèi)皮細胞表型分化，計量分析12d細胞擴增數(shù)量，并對誘導(dǎo)細胞進行鑒定，指標為：細胞形態(tài)學(xué)觀察、DiI-acLDL攝取實驗、UEA結(jié)合實驗、CD31和vWF免疫組織化學(xué)染色。

5、 2．消化、收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代內(nèi)皮細胞，以1×10<'6>密度接種于纖維蛋白凝膠中，并定期觀察細胞生長情況；利用MTT法繪制生長曲線，切片作HE染色。采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)，將第二代誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞以1×10<'7>/ml濃度種于脫鈣骨基質(zhì)支架，體外培養(yǎng)并定期觀察其在支架內(nèi)的生長情況，6d后行電鏡觀察，切片作HE染色。 3．建立兔尺骨大段骨缺損動物模型，并按以下分組進行體內(nèi)成血管實驗研究。①空白組：不進行植入；②對照組

6、：生物蛋白凝膠+支架；③實驗組：誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞+生物蛋白凝膠+支架復(fù)合物。每個時相點6例標本。分別于2，4，8w拍X片，行墨汁灌注，切片HE染色，Brdu免疫熒光，CD31和Brdu免疫組織化學(xué)染色并計算微血管密度。 結(jié)果： 1．細胞接種后24h可觀察到明顯的細胞集落形成，細胞集落成典型中央小圓形細胞周圍短梭形細胞放射生長，4d集落開始從外圍散開。1ml骨髓經(jīng)本誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)處理后，傳代培養(yǎng)12-14d后收獲細胞(3.06

7、±0.42)×10M<'6>個。誘導(dǎo)細胞呈單層鋪路石樣生長，可攝取低密度脂蛋白、可結(jié)合凝集素、陽性表達CD31和vwF抗原。 2．兔MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代細胞在纖維蛋白凝膠內(nèi)培養(yǎng)1d后細胞開始變形，3d后梭形鋪開，6d后細胞間形成連接，細胞在纖維蛋白凝膠內(nèi)生長曲線成“S”形，切片HE染色示細胞生長良好。兔MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代內(nèi)皮細胞通過纖維蛋白凝膠接種在支架內(nèi)培養(yǎng)1d后細胞開始變形，3d后梭形鋪開，6d后細胞間形成連接，電

8、鏡檢查支架空隙內(nèi)可見類似內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)。 3．X線、大體標本及HE染色示實驗組較對照組骨痂生成更規(guī)則完整，而空白組未見明顯骨缺損修復(fù)；實驗組較對照組和空白組4w及8w時墨汁灌注示血管更豐富；切片CD31組織化學(xué)染色并計算微血管密度，2，4，8w實驗組較對照組新生骨組織中微血管密度均更高，統(tǒng)計學(xué)上有明顯差異(P<0.01)；Brdu熒光和免疫組織化學(xué)染色顯示標記陽性的細胞參與血管形成。 結(jié)論 1．骨髓經(jīng)Percoll分

9、離液梯度離心獲取的骨髓單個核細胞經(jīng)EGM-2培養(yǎng)液誘導(dǎo)可以分化為具有特定表型、增殖能力較強的足量的內(nèi)皮細胞表型的細胞。 2．兔骨髓單個核細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞在纖維蛋白凝膠內(nèi)生長增殖良好，纖維蛋白凝膠可以作為其接種載體。 3．采用纖維蛋白凝膠雙相接種的兔骨髓單個核細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞-脫鈣骨基質(zhì)支架復(fù)合物內(nèi)植入細胞分布均勻，體外培養(yǎng)6d可見類似內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)形成，證實誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞能通過體外培養(yǎng)將脫鈣骨基質(zhì)支架進行初步血管化。