內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建血管化組織工程骨的研究.pdf

1、目的:
　　 1.體外原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，EC)，培養(yǎng)人成骨細(xì)胞(Osteoblasts，OB)，按照內(nèi)皮細(xì)胞:成骨細(xì)胞分別為1:0、8:1、4:1、1:1、1:4、1:8、0:1在24孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)。觀察不同比例下內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)其成血管和成骨作用的影響。
　　 2.通過(guò)燒結(jié)法和凍干法制作CS/HA三維多孔支架，并對(duì)其細(xì)胞相容性及毒

2、性進(jìn)行研究。為下一部分的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 3.探討大鼠BMSCs來(lái)源的成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架植入大鼠橈骨缺損處，觀察其成骨作用和成血管作用。
　　 方法:
　　 1.無(wú)菌環(huán)境下取本院新生兒臍帶25cm，并經(jīng)由新生兒家屬同意。在止血鉗內(nèi)側(cè)用碘酒和酒精棉球消毒后，用無(wú)菌剪刀將兩端臍帶剪除。在臍帶一端找到靜脈，插入臍帶靜脈插管，用2根粗絲線扎牢，用含有雙抗的PBS沖洗靜脈腔，直到?jīng)_

3、洗液無(wú)色清涼時(shí)。趕出靜脈腔內(nèi)殘余液體，將臍帶另一端用止血鉗夾閉，用10ml注射器連接針頭，注入37℃預(yù)熱的0.1％Ⅰ型膠原酶約8ml，放入37℃緩沖液中保溫10min。每隔5分鐘，輕輕搖動(dòng)一次，以促使其充分消化。消化完畢后，用手輕輕揉擠臍靜脈，吸出靜脈腔內(nèi)Ⅰ型膠原酶所消化的細(xì)胞懸液，加入預(yù)加有緩沖液的離心管中，沖洗靜脈腔，一并加入離心管中。離心1500rpm，10min棄上清，用7ml10％胎牛血清，高糖DMED（100U/mL青霉素+

4、鏈霉素，50μg/mL維生素C）重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，放5％CO2孵箱培養(yǎng)。第二天換液，用PBS輕輕洗一遍，去除紅細(xì)胞和未貼壁的細(xì)胞，每隔2-3天換液一次，7-10天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底。按照1:2的比例消化傳代。采用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變化。人第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)來(lái)對(duì)原代分離培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。人成骨細(xì)胞株MG63購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，在37℃水浴下迅速?gòu)?fù)蘇后，用含10％胎牛血清的高糖DMED(100U/

5、mL青霉素+鏈霉素，50μg/mL維生素C)進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、5％CO2，飽和濕度。平均2天換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底進(jìn)行1:2傳代。傳代時(shí)采用0.25％胰蛋白酶消化。對(duì)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞每日均在顯微鏡下觀察，了解細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)及形態(tài)變化等特點(diǎn)。繪制內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人成骨細(xì)胞細(xì)胞按照單純內(nèi)皮細(xì)胞、8:1、4:1、1:1、1:4、1:8、單純成骨細(xì)胞的比例進(jìn)行混合作為實(shí)驗(yàn)組，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人成骨細(xì)胞到分別單純

6、單層培養(yǎng)作為對(duì)照組。在第21天時(shí)采用細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒進(jìn)行染色，來(lái)觀察鈣化情況。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)各組VEGF表達(dá)水平。在第7、14、21天時(shí)將共培養(yǎng)各組每孔中的培養(yǎng)液收集，按照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)觀察各組堿性磷酸酶含量。來(lái)綜合研究不同比例共培養(yǎng)對(duì)其成骨和成血管作用的差別。
　　 2.HA三維多孔支架經(jīng)燒結(jié)法制作而成，且購(gòu)自于四川大學(xué)。稱取CS粉末，將其溶于醋酸，制成3％(w/v)的溶液，

7、再加入適量聚乙二醇后，1500rpm/min離心10分鐘。將HA支架先放入自制的模具中，將CS溶液攪拌均勻并無(wú)氣泡后，倒入模具中成型。然后將其放入-20℃冷凍2小時(shí)。再將其放入冷凍干燥機(jī)中，進(jìn)行凍干16小時(shí)。水分被低溫升華后，CS/HA多孔支架即可制備好。用PBS反復(fù)沖洗支架，以中和支架內(nèi)參與的醋酸。采用乙醇置換法測(cè)定支架的孔隙率和密度。取1月齡雄性SD大鼠，斷頸處死后75％乙醇浸泡5min，無(wú)菌條件下取兩側(cè)脛骨和股骨。清理骨組織表面的

8、肌肉等軟組織，剝除骨膜以及干骺端軟骨層。用剪刀小心剪開(kāi)兩端干骺端，用低糖DMEM培養(yǎng)基（300U/mL青霉素+鏈霉素）反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗出來(lái)的骨髓懸液離心10min1500rpm/miin，棄上清后加入低糖DMEM培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液，以5×106個(gè)細(xì)胞/每T175培養(yǎng)瓶中，放入5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃下培養(yǎng)，2天后首次換液，之后每3天換液一次。待BMSCs長(zhǎng)滿瓶底90％時(shí)，按照1:2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳至第3代時(shí)備用。采用

9、倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變化。將制備的CS/HA三維多孔支架事先用環(huán)氧乙烷消毒。收集第3代BMSCs，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于支架中，培養(yǎng)7天后，采用掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)狀況。采用MTT法觀察CS/HA三維多孔支架浸提液對(duì)BMSCs生長(zhǎng)的影響。
　　 3.1月齡SD雄性大鼠8只，體重90-110g;2月齡雄性SD大鼠30只，體重200-220g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

10、分離和培養(yǎng)方法參見(jiàn)方法2。將生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs加入含LG-DMEM培養(yǎng)基、10％胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50μg/ml維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中。每3d更換培養(yǎng)液1次。取誘導(dǎo)培養(yǎng)7天之后的成骨細(xì)胞置于放有無(wú)菌蓋玻片的24孔板中，行ALP染色鑒定。將生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs加入含LG-DMEM培養(yǎng)基、10％胎牛血清、2μg/LbFGF、10μg/mlVEGF的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，每

11、3天更換培養(yǎng)液1次。取誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行CD34和CD31免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架第二部分實(shí)驗(yàn)已經(jīng)制作完畢，環(huán)氧乙烷消毒后使用。收集誘導(dǎo)7天的成骨細(xì)胞和誘導(dǎo)14天的內(nèi)皮細(xì)胞，用含10％胎牛血清的LG-DMEM制成5×106/ml細(xì)胞懸液。分組如下，2月齡雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分成3組，每組10只，A組:單純EC-支架復(fù)合物;B組:單純OB-支架復(fù)合物;C組:OB-EC-支架復(fù)合物(1:1)。按照細(xì)胞

12、懸液反復(fù)滴加的方法，將單純EC、單純OB、OB-EC細(xì)胞均勻分布于殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架上，將細(xì)胞支架復(fù)合物放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)后，待細(xì)胞粘附于支架表面后，加入含10％胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液，2天換液一次，在體外培養(yǎng)7天后植入大鼠橈骨骨缺損模型的缺損部位。MTT測(cè)定支架內(nèi)細(xì)胞增殖情況。取2月齡雄性SD大鼠，3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，取仰臥位，常規(guī)脫毛，消毒，切開(kāi)皮膚分離肌肉，暴漏橈骨中段，用手術(shù)剪剪

13、出5mm長(zhǎng)的骨缺損。將30只大鼠平均分為3組，每組10只。將A，B，C三組的細(xì)胞支架復(fù)合物植入大鼠橈骨缺損處，逐層縫合傷口。移植術(shù)后第4、8、12周時(shí)，取出植入物，4％甲醛固定，EDTA脫鈣，酒精逐級(jí)脫水，包蠟，做石蠟切片，行HE染色、免疫組化法檢測(cè)CD34表達(dá)。采用CD34免疫組化染色法來(lái)計(jì)算移植物內(nèi)微血管數(shù)量。顯微鏡下找到血管密度高的區(qū)域，在200倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的微血管數(shù)量，取其平均值作為移植物微血管密度。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢

14、測(cè)各組移植物內(nèi)OPG(osteoprotegerin，OPG)、OPN基因表達(dá)情況。
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD法，P值＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞均成功培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種2小時(shí)，開(kāi)始貼壁，最初表現(xiàn)為多角形扁平樣，后慢慢變成長(zhǎng)梭形，有些細(xì)胞排列成渦旋狀。7-10天后

15、長(zhǎng)成單層，呈單層鋪路石狀排列。成骨細(xì)胞在接種的8h左右，細(xì)胞開(kāi)始貼壁。剛貼壁的細(xì)胞形態(tài)多樣，而且無(wú)排列規(guī)律。細(xì)胞最初呈梭型，多有突起。細(xì)胞核偏向一側(cè)，且成卵圓形，胞漿較多。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定的內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性率高達(dá)98.4％。共培養(yǎng)各組細(xì)胞在21天中生長(zhǎng)良好，第14天EC∶OB/1:8組可見(jiàn)成骨細(xì)胞開(kāi)始集落式生長(zhǎng)，并與內(nèi)皮細(xì)胞界限清楚。第21天EC∶OB/1:4組鈣化染色結(jié)節(jié)要明顯強(qiáng)于EC∶OB/1:8組，而單純OB組并未出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。E

16、C∶OB/1:4組堿性磷酸酶含量在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯增高(P＜0.05)。單純EC組細(xì)胞分泌的堿性磷酸酶含量在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較其他組處于最低。在EC∶OB為8:1、4:1、1:1的三個(gè)組，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到VEGF的表達(dá)。在EC∶OB為1:4的組，第7天時(shí)VEGF開(kāi)始增高，直到第21天時(shí)達(dá)到高峰。
　　 2.CS/HA支架經(jīng)凍干法成功制得。大鼠BMSCs成功分離及培養(yǎng)。BMSCs原代細(xì)胞接種后觀察可有少量圓形細(xì)胞逐漸貼壁。48h貼

17、壁細(xì)胞增多。細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，胞核較大，胞漿豐富。培養(yǎng)72h后BMSCs開(kāi)始分裂，形成細(xì)胞集落，培養(yǎng)10天左右開(kāi)始融合。傳代至第4代時(shí)，仍可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，增殖活力強(qiáng)。乙醇置換法測(cè)得支架的孔隙率約為90.1±3.6％，支架密度為0.085±0.013g/cm3。掃描電鏡可見(jiàn)CS/HA支架內(nèi)遍布大小均一的孔，孔徑為150-300μm，平均250μm?？梢钥吹郊?xì)胞較好的粘附于支架表面。也提示CS/HA支架生物相容性較好。MTT法檢測(cè)原培

18、養(yǎng)液組、浸提液組、1/2浸提液組細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)三組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。揭示支架浸提液對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響。CS/HA支架對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害。
　　 3.大鼠BMSCs成功分離培養(yǎng)。第三代BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7天后，ALP染色后，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)染顆粒，細(xì)胞核染成紅色。第三代BMSCs經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)14天后，CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕色染色顆粒。MTT結(jié)果顯示三組OD值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸升高。

19、B組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的微血管密度均明顯低于其他兩組。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A組和C組的微血管密度明顯升高，到第12周時(shí)，微血管密度分別為36.35±5.41、32.37±4.08(P＜0.05)。術(shù)后12周，HE染色顯示A組未見(jiàn)明顯的類骨質(zhì)形成，而有較密集的微血管結(jié)構(gòu)，并且有較多的纖維組織形成。B組和C組可見(jiàn)均質(zhì)的類骨質(zhì)，呈條索狀和島狀分布。可見(jiàn)大量成骨樣細(xì)胞存在。A組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)OPN和OPG表達(dá)水平較低，第12周時(shí)，B組和C組OPN表達(dá)分別為GA

20、PDH的3.8和4.2倍。第4周時(shí)，B組和C組OPG表達(dá)分別為GAPDH的3.2和2.7倍。
　　 結(jié)論:
　　 1.內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)比例為4:1時(shí)，成血管作用較強(qiáng)，而比例為1:4時(shí)成骨作用更強(qiáng)。
　　 2.CS/HA三維多孔支架生物相容性較好，細(xì)胞毒性低，是一種較為理想的骨組織工程三維支架。
　　 3.BMSCs源性的成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞按照1:1的比例共培養(yǎng)于殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架作為組織工