大鼠雪旺細(xì)胞與成骨細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建神經(jīng)化組織工程骨的前期研究.pdf

1、目的：
　　 1．體外原代培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、GFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(GFP-BMSCs)、成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)、雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)、感覺神經(jīng)元(dorsal rootganglion，DRG)、交感神經(jīng)元(superior cervical ganglion，SCG)細(xì)胞。觀察DRG

2、、SCG、SCs對GFP-BMSCs分化的成骨細(xì)胞增殖的影響。SCs對BMSCs分化OB及顱骨來源OB增殖的影響及機(jī)制研究。
　　 2．研究采用熒光微球655（Quantum dot655， QD655）標(biāo)記大鼠BMSCs體外可行性研究。探討此染料對大鼠BMSCs的毒性、增殖、成骨分化、動(dòng)態(tài)標(biāo)記率等功能，為體內(nèi)示蹤研究打下研究基礎(chǔ)。
　　 3．研究膠原-生物活性玻璃材料的生物相容性研究，包括溶血試驗(yàn)，浸提液對RSC96細(xì)

3、胞株增殖試驗(yàn)，膠原-生物活性玻璃干濕態(tài)下力學(xué)強(qiáng)度研究，最佳接種液體量研究，最佳接種方式方式研究、BMSCs與SCs粘附于材料增殖研究，材料對細(xì)胞促增殖試驗(yàn)及向成骨促分化試驗(yàn)，以及初步體內(nèi)皮下包埋驗(yàn)證成骨試驗(yàn)。
　　 4．探討采用克氏針與快速成型技術(shù)制成接骨板固定大鼠8mm骨缺損穩(wěn)定性研究，采用體內(nèi)軸向壓縮生物力學(xué)測試及體內(nèi)動(dòng)態(tài)觀察固定失效率進(jìn)行試驗(yàn)，探求兩種固定方式的方法、手術(shù)技巧、優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)，探求合適固定大鼠骨缺損固定方式。<

4、br>　　 5．探討采用大鼠隱動(dòng)靜脈及隱神經(jīng)束作為神經(jīng)血管束移植作為外源性因素同步構(gòu)建神經(jīng)血管化組織工程骨的可行性，以及采用熒光微球標(biāo)記的SCs與GFP轉(zhuǎn)染的成骨細(xì)胞聯(lián)合負(fù)載于膠原-生物活性玻璃體內(nèi)示蹤可行性研究。
　　 方法：
　　 1．以2周齡SD大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型，采用股骨、脛骨骨髓沖洗法收集細(xì)胞，以培養(yǎng)的第3代BMSCs用于試驗(yàn)；采用1d齡乳鼠2只，采用75％酒精浸泡15min，無菌取出顱骨，采用無菌眼科剪建成

5、1-2mm3碎片。向剪碎的骨組織中加入1mL0.25%的胰蛋白酶37℃，消化90min，稍離，去上清。加入0.2%Ⅰ型膠原酶3-5mL，37℃，連續(xù)消化2次60min。中止消化，收集細(xì)胞，重復(fù)上述試驗(yàn)，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，以后每2～3d換液1次。達(dá)到80%～90%融合時(shí)(原代培養(yǎng)3～5d)，消化傳代，分組培養(yǎng)，采用堿性磷酸酶染色進(jìn)行鑒定，2-5代用于試驗(yàn)；采

6、用15d孕鼠，無菌取出胎鼠，取背根神經(jīng)節(jié)，0.25%胰酶消化50min，種植到預(yù)先鋪板的蓋玻片上，進(jìn)行感覺神經(jīng)元培養(yǎng)；采用1d齡乳鼠，取頸上神經(jīng)節(jié)，0.25%胰酶消化30min，種植到預(yù)先鋪板的培養(yǎng)板；取1d乳鼠，取出坐骨神經(jīng)及臂叢神經(jīng)，采用組織塊貼壁法獲得SCs。采用P3BMSCs向成骨誘導(dǎo)分化2周，進(jìn)行鑒定；分別采用SCs、DRG、SCG與顱骨來源成骨細(xì)胞和BMSCs來源成骨細(xì)胞共培養(yǎng)檢測，檢測共培養(yǎng)后成骨細(xì)胞增殖及分化機(jī)制。

7、>　　 2．采用QD655按照試劑盒推薦濃度，分別將QD試劑A和試劑載體B各取1μL混置于1.5mL微量離心管中，放于孵育15min，加入100μL培養(yǎng)基，渦旋30s，向管中加入含106個(gè)P3細(xì)胞的0.2mL懸液，打勻后置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，用完全培養(yǎng)基漂洗兩遍后，在熒光顯微鏡下檢測。根據(jù)QD試劑推薦濃度標(biāo)記第3代細(xì)胞(P3)為試驗(yàn)組，以未用QD標(biāo)記的細(xì)胞作為空白對照組。用苔盼藍(lán)拒染法檢測標(biāo)記后細(xì)胞存活率，用MT

8、T法觀察染料對細(xì)胞增殖性的影響，采用茜素紅、堿性磷酸酶染色、real-time PCR鑒定對成骨分化的影響；分別在標(biāo)記后即刻、1w、2w、4w、6w利用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)檢測兩組標(biāo)記時(shí)間和陽性率；并用電鏡觀察標(biāo)記后細(xì)胞在材料的貼附性。
　　 3．華南理工大學(xué)材料學(xué)院提供膠原-生物活性玻璃，提取材料浸提液，實(shí)施溶血試驗(yàn)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)，將細(xì)胞粘附材料分別于1d、3d、5d、7d進(jìn)行對比電鏡觀察，并將SCs負(fù)載與膠原-生物活性玻璃上，采用

9、電鏡觀察材料對SCs貼壁情況；采用膠原-生物活性玻璃在干濕態(tài)下，對濕態(tài)下膠原材料進(jìn)行力學(xué)強(qiáng)度對比；取6塊6×8mm2，采用微量注射器，每20μL液體量滴加材料，直至材料地面有液體滲出為止，統(tǒng)計(jì)注射液體量，計(jì)算最佳加液量；采用5點(diǎn)注射，分別于材料表面0mm、2mm、4mm進(jìn)行梯度注射尋求最佳注射位點(diǎn)；取P3代BMSCs接種于材料及24孔板中，其中一部分材料采用SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，一部分材料采用成骨誘導(dǎo)，分別于與之相同培養(yǎng)基

10、的細(xì)胞進(jìn)行對比，2w后采用real-time PCR進(jìn)行檢測，檢測成骨分化程度。取P3BMSCs向成骨分化2周，種植在膠原-生物活性玻璃上，切成1ml薄片皮下包埋裸鼠背部，將觀察材料有誘導(dǎo)成骨性能。
　　 4．采用快速成型技術(shù)，自行設(shè)計(jì)塑料接骨板，材料為進(jìn)口無毒材料。制備SD大鼠股骨8mm骨缺損。共采用12只350-500g大鼠處死，取出股骨進(jìn)行接骨板固定與克氏針?biāo)鑳?nèi)固定，測試軸向生物力學(xué)強(qiáng)度，檢測兩種固定方式軸向抗壓縮能力；取

11、24只350-500g大鼠隨機(jī)分為A組與B組，A組采用接骨板固定，B組采用克氏針固定。分別于術(shù)后2w、4w、8w進(jìn)行X線片，評價(jià)固定缺損穩(wěn)定狀況，總結(jié)兩組失敗率及類型，總結(jié)適合大鼠最佳固定方式。
　　 5．采用9只150-200g SD大鼠，暴露并游離隱動(dòng)靜脈隱神經(jīng)束，移植于預(yù)先處理的膠原-生物活性玻璃，于術(shù)后3d、7d、14d采用冰凍切片進(jìn)行HE染色觀察血管網(wǎng)形成；采用GFP轉(zhuǎn)染BMSCs向體外誘導(dǎo)成骨2周，采用Qtracke

12、r655標(biāo)記大鼠SCs接種于膠原-生物活性玻璃上，移植于大鼠8mm骨缺損體內(nèi)1周后取出采用共聚焦觀察兩種細(xì)胞示蹤可行性。
　　 結(jié)果：
　　 1．原代SD大鼠BMSCs、OB、DRG、SCG、SCs培養(yǎng)成功，DRG于共培養(yǎng)5d時(shí)，對成骨細(xì)胞較空白對照組有明顯的促增殖作用，有顯著性差異(相應(yīng)F=0.802，P=0.007)而與其他對照組及無明顯差別，SCG各個(gè)時(shí)間段對顱骨來源成骨細(xì)胞較對照組均無促增殖作用(P＞0.05)。

13、采用96孔共培養(yǎng)板，共培養(yǎng)1d、3d、5d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，共培養(yǎng)7d、9d兩個(gè)時(shí)間段SCs對成骨細(xì)胞有明顯的促增殖作用，較對照組均有顯著性差異(P＜o(jì)．05)。SCs對BMSCs來源OB在共培養(yǎng)1、3d兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，余下3個(gè)時(shí)間段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，試驗(yàn)組由于對照組。SCs在3d、5d、7d對成骨細(xì)胞作用在ALP、OPN、OCN、BMP-2、CollamRNA較未共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞均低表達(dá)，表明SCs對成骨細(xì)胞起抑制分化作用。而對BMSC

14、s來源成骨細(xì)胞，在ALP、OPN、OCN、BMP-2、CollamRNA在3d是均有高表達(dá)，ALP、Colla在第7d呈低表達(dá)，提示SCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境中對BMSCs來源的成骨細(xì)胞起到促分化作用。
　　 2．試驗(yàn)組與對照組細(xì)胞存活率均＞90%，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；培養(yǎng)1、3、5、7、9d兩組增殖率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0，05）。標(biāo)記的BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化2周后，茜素紅及ALP染色均呈陽性，實(shí)時(shí)熒光定

15、量PCR檢測經(jīng)標(biāo)記的BMSCs的OPNmRNA、BglapmRNA、Colla1mRNA、Alp1mRNA、Bmp2mRNA較對照組均呈高表達(dá)。熒光顯微鏡下胞漿呈紅色熒光，標(biāo)記后即可標(biāo)記率可達(dá)96.5±1.59%，隨著標(biāo)記時(shí)間的增加，標(biāo)記率下降，分別為1w93.30±1.51%、2w72.40±2.90%、4w40.10±3.60%、6w10.00±1.70%，對照組各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記陽性率均為0；掃描電鏡觀察標(biāo)記后細(xì)胞和材料貼附良好。

16、>　　 3．采用膠原-生物活性玻璃材料中，采用支架材料浸提液，對兔靜脈血沒有產(chǎn)生溶血作用，對RSC96增殖較對照組在各個(gè)時(shí)間段均無抑制作用；采用軸向壓縮測試力學(xué)強(qiáng)度，證實(shí)濕態(tài)下支架材料的強(qiáng)度高于膠原組織，而明顯低于干性支架材料；采用逐漸加液體的方法，探討出最佳加液量為0.88ml/cm3；采用五點(diǎn)梯度為2mm為最佳注射方法，可將細(xì)胞均勻種植到材料上；材料對BMSCs起到抑制分化作用；膠原-生物活性玻璃負(fù)載成骨細(xì)胞包埋裸鼠體內(nèi)可以形成骨

17、質(zhì)，構(gòu)建的組織工程骨具在BMP-2、OPN、CollamRNA較正常骨高表達(dá)，提示組織工程骨處于快速成骨期。
　　 4．克氏針?biāo)鑳?nèi)固定及接骨板固定兩種方式手術(shù)技巧討論，克氏針固定較接骨板固定更為方便，所需要時(shí)間更短，兩者存在顯著性差異(P＜0.05)。并術(shù)后2、4、8w進(jìn)行X線片統(tǒng)計(jì)固定失效率，并在體外進(jìn)行軸向壓縮生物力學(xué)檢測。探討最佳固定方式。發(fā)現(xiàn)在體外生物力學(xué)強(qiáng)度測試中，接骨板軸向壓縮所受力為40.38±4.04，克氏針壓縮

18、失效值所受力為29.53±2.95，克氏針徹底失效值所受力為58.49±5.85，三組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在動(dòng)態(tài)X線片觀察中發(fā)現(xiàn)，克氏針組出現(xiàn)失敗率為91.67%(11/12)，接骨板失敗率為16.67%(2/12)。本部分研究得出在大鼠股骨骨缺損中，應(yīng)采用接骨板固定更為理想。
　　 5．在大鼠模型中可采用隱動(dòng)脈、隱靜脈、隱神經(jīng)束作為整體血管神經(jīng)束移植構(gòu)建血管神經(jīng)化組織工程骨，HE染色鑒定材料有較多血管形成，并隨時(shí)

19、間遞增血管分布密度增加。可采用慢病毒GFP轉(zhuǎn)染BMSCs以及QD655標(biāo)記SCs種植到膠原-生物活性玻璃進(jìn)行體內(nèi)示蹤。證實(shí)隱動(dòng)脈、靜脈、神經(jīng)束可以作為整體進(jìn)行移植，在材料內(nèi)可以形成較多血管組織。在共聚焦顯微鏡下可以對兩種細(xì)胞進(jìn)行示蹤，并在一周的X線片中可以發(fā)現(xiàn)有成骨形成。
　　 結(jié)論：
　　 1．DRG可能對成骨細(xì)胞起到促增殖作用；SCG對成骨細(xì)胞不起到促增殖作用；SCs對成骨細(xì)胞起到明顯的促增殖作用；SCs對顱骨來源的

20、成骨細(xì)胞起到抑制分化作用；對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的成骨細(xì)胞起到促進(jìn)分化作用。
　　 2．Qtraker655對大鼠BMSCs標(biāo)記時(shí)間長，標(biāo)記率及安全性高，并不改變細(xì)胞的成骨性能，是一種良好標(biāo)記物。
　　 3．膠原-生物活性玻璃是一種生物相容性好，可構(gòu)建骨組織的支架材料。
　　 4．在大鼠股骨骨缺損固定中，接骨板效果優(yōu)于克氏針?biāo)鑳?nèi)固定。
　　 5．在大鼠構(gòu)建神經(jīng)血管化組織工程，隱動(dòng)靜脈隱神經(jīng)束可作為外源性因