組織工程化培養(yǎng)模型下力學載荷與植物雌激素聯(lián)合調(diào)控小鼠前成骨細胞及骨重建機制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種代謝性疾病,其特征是骨量下降和骨的微細結(jié)構(gòu)破壞,表現(xiàn)為骨的脆性增加,因而骨折的危險性大為增加。隨著我國乃至全球老年人口的增加,骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率處于上升趨勢,被世界衛(wèi)生組織列為中老年三大疾病之一。OP主要發(fā)病機制是機體的骨重建失衡。當破骨細胞(osteoclast,OC)行使的骨吸收作用大于成骨細胞(osteoblast,OB)行使的骨形成作用時就會發(fā)生OP。骨

2、重建是一個多因素參與的復雜過程,力學載荷和雌激素都是影響其主要因素。實驗探討植物雌激素α-玉米赤酶醇(α-Zearalanol,α-ZAL)為代表的化學信號和以力學載荷為代表的物理信號耦合作用對骨重建的影響,通過建立二維和三維,組織工程化培養(yǎng)模型,考察OB對這兩種不同信號的生物學響應機制。研究結(jié)果為戰(zhàn)傷骨折救治提供了理論基礎(chǔ),也為預防OP,由“被動醫(yī)療”轉(zhuǎn)向“主動健康”提供臨床參考。因此,研究工作對于相關(guān)骨疾病的治療與康復進行了有意義的

3、探索。
　　研究方法：
　　1.傳代培養(yǎng)小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1,采用不同濃度α-ZAL作用于細胞72h后,MTT法檢測細胞增殖活性,PNPP法檢測ALP活性,RT-PCR檢測ALP、OPG及RANKLmRNA的表達水平;
　　2.采用四點彎曲力學加載裝置,選擇頻率為0.5Hz,強度1000με和2500με的力學拉伸應變作為力學加載組,α-ZAL(10-6、10-8、10-10M)作為藥物作用組,對MC3T3

4、-E1細胞進行單獨作用及聯(lián)合作用。力學加載方式為1次/d,1h/次。細胞處理72h后,采用流式細胞術(shù)檢測細胞增殖情況;PNPP法檢測ALP活性;realtimeRT-PCR檢測ALP、Runx2、OPG及RANKLmRNA的表達水平;Westernblot分析方法檢測RUNX2、OPG及RANKL蛋白表達;
　　3.殼聚糖與透明質(zhì)酸進行交聯(lián)改性,改性后與膠原按不同比例制備三種改性殼聚糖/膠原/羥基磷灰石復合支架;對改性后的殼聚糖進

5、行紅外和差示掃描量熱圖譜進行結(jié)構(gòu)分析;考察復合支架的孔徑、孔隙率、密度、力學強度等理化性質(zhì);支架接種細胞后考察細胞生長曲線并進行HE染色等形態(tài)學觀察;
　　4.應用動態(tài)載荷與循環(huán)灌流反應器培養(yǎng)細胞-支架復合物。CCK-8法檢測三種不同流速(5,10,20ml/min)和3500με力學壓載(1Hz,2h/d)的力學環(huán)境下成骨細胞的增殖能力;SEM考察細胞支架復合物表面和內(nèi)部細胞的分布及形態(tài);免疫組化染色和Westernblot分析

6、法考察細胞分化標志蛋白表達情況。VonKossa礦化結(jié)節(jié)染色法考察細胞支架復合物動態(tài)培養(yǎng)礦化情況;
　　5.在三維動態(tài)培養(yǎng)細胞支架復合物體系中加入不同濃度的α-ZAL(10-6、10-8、10-10M),CCK-8法檢測增殖,PNPP法檢測ALP活性,Westernblot分析OPG,RANKL蛋白表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1.10-6-10-12Mα-ZAL可顯著抑制成骨細胞的增殖(P<0.05);10-6-10-

7、12Mα-ZAL均可使ALP活性增加(P<0.05),但不同劑量間存在作用時間差異。10-6-10-10Mα-ZAL均可上調(diào)成骨細胞內(nèi)OPG/RANKLmRNA的比值(P<0.05);
　　2.力學拉伸單獨作用于成骨細胞可促進細胞增殖,ALP活性以及RUNX2蛋白表達,并可以提高OPG/RANKL比值。雖然力學載荷與α-ZAL耦合后仍然抑制成骨細胞增殖,但高濃度α-ZAL(10-6M)耦合高強度拉伸應變(2500με)能夠顯著提高

8、ALP活性;α-ZAL耦合高強度拉伸應變能夠顯著上調(diào)RUNX2蛋白表達。α-ZAL耦合低強度拉伸應變(1000με)可顯著上調(diào)OPG/RANKL比值;
　　3.紅外和差示掃描量熱圖譜證明透明質(zhì)酸和殼聚糖以酰胺鍵形成交聯(lián)的新化合物;掃描電鏡顯示孔徑在50-250mm之間,孔隙率分別為46.2±1.88,50.4±5.14,62.5±4.53(％);密度分別為0.1049±0.24,0.0921±8.01,0.0509±5.34(g/

9、ml);彈性模量分別為:1.51±0.19,29.31±0.38,36.94±0.25(KPa);生長曲線結(jié)果:前7天B、C樣品中活細胞數(shù)量明顯高于A樣品,從第10d開始,三種樣品中細胞數(shù)量相差不大,均出現(xiàn)平臺期;HE染色發(fā)現(xiàn)成骨細胞在培養(yǎng)初期沿著支架材料內(nèi)部空隙貼壁生長,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,貼壁細胞呈集落樣生長,可明顯看到細胞間連接;
　　4.利用生物反應器動態(tài)培養(yǎng)細胞支架復合物,選擇灌流流速為10ml/min顯著促進MC3T3

10、-E1細胞增殖;支架接種細胞并且動態(tài)培養(yǎng)5d后,細胞黏附于支架壁呈梭形和不規(guī)則形狀,伸出偽足,分泌少量的絨毛和ECM;COLI、OPN和OCN的免疫組化染色均為陽性;Westernblot分析結(jié)果動態(tài)培養(yǎng)7d時COLI的表達量顯著上調(diào);OPN的表達顯著下降;OCN在體外培養(yǎng)12d后表達量沒有發(fā)生改變;
　　5.高濃度α-ZAL抑制三維動態(tài)培養(yǎng)成骨細胞增殖,并促進ALP活性的增加。通過上調(diào)OPG蛋白表達,下調(diào)RANKL蛋白表達而增加

11、OPG/RANKL比值。
　　結(jié)論：
　　1.α-ZAL為新近發(fā)現(xiàn)一類植物雌激素,對成骨細胞活性的影響尚未見文獻報道。研究發(fā)現(xiàn)α-ZAL可抑制成骨細胞的增殖、促進分化,并可通過上調(diào)OPG/RANKLmRNA表達比值抑制破骨細胞的活化,有望成為OP的治療藥物;
　　2.拉伸應變可有效促進成骨分化,且具有強度依賴性;當與化學信號耦合,能進一步上調(diào)成骨細胞分化能力;但低強度拉伸應變耦合α-ZAL通過上調(diào)OPG/RANKL比值

12、更有利于抑制破骨細胞活化,調(diào)節(jié)骨重建;
　　3.透明質(zhì)酸改性殼聚糖/膠原/納米羥基磷灰石復合材料作為一種新型有機無機復合支架材料,有利于促進成骨細胞黏附、增殖,同時也可為三維藥物篩選提供良好平臺;
　　4.生物反應器的研發(fā)與應用成為三維培養(yǎng)不可缺少的技術(shù)平臺。應用自主研發(fā)的循環(huán)灌流和動態(tài)壓載反應器可實現(xiàn)組織工程骨的體外培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)流速10ml/min聯(lián)合3500με壓應變的參數(shù)條件較適合細胞支架復合物的動態(tài)培養(yǎng)。OB在HA