四類植物雌激素對大鼠成骨細胞生物活性影響比較研究.pdf

1、目的:骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是一種多病因的增齡性病變,它的主要臨床表現(xiàn)為腰背髖部疼痛,彎腰,駝背,身高變矮,輕微外傷就可以造成骨折。它基本病理機制是骨代謝過程中破骨細胞(OC)的骨吸收增加與成骨細胞(OB)的骨形成減少,從而導致人體內(nèi)的鈣磷代謝不平衡,骨密度(Bonemineral density,BMD)逐漸降低進而形成骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松可以分為兩大類:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松。其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松經(jīng)濟負擔重,社會壓力大,已成為嚴

2、重的公共健康問題。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病與絕經(jīng)后雌激素分泌不足密切相關,臨床上對絕經(jīng)后PMOP經(jīng)典的治療方法是雌激素替代療法(ERT),其療效肯定,但長期應用有增加冠心病、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等發(fā)生的副作用,因此尋找更為理想的化合物治療絕經(jīng)后PMOP成為人們亟待解決的問題。近年來有報道稱植物雌激素(phytoestrogen,PE)可以有效預防PMOP,同時也不伴有ERT的并發(fā)癥。
　　 植物雌激素(phytoestrogen,PE

3、)是主要存在于植物、水果和蔬菜中的一類天然的,結構及生物活性均類似于雌激素的非甾體類化合物,具有弱雌激素活性,為雜環(huán)多酚類化合物。PE可以與雌激素受體結合,對內(nèi)源性雌激素起雙向調(diào)節(jié)的作用,在改善圍絕經(jīng)期癥狀、降低血脂水平,防止骨質(zhì)疏松等方面起著有益作用。以切除卵巢的授乳大鼠模型做實驗,這些大鼠哺乳的幼鼠普遍存在骨量丟失,骨密度下降等癥狀。而喂養(yǎng)添加植物雌激素飼料的授乳幼鼠,骨密度明顯增高,說明植物雌激素有預防骨質(zhì)疏松的作用。植物雌激素與

4、雌激素的作用相似,可與破骨細胞內(nèi)的受體結合,抑制破骨細胞的活性;當與成骨細胞的受體結合時,可刺激成骨細胞分泌膠原酶,釋放生長因子和細胞因子,增強成骨細胞的活性,促進骨質(zhì)生長,加速骨形成,可有效地預防骨質(zhì)疏松的形成。
　　 植物雌激素可以分為異黃酮類(Isoflavones),香豆素類(Coumarin)木脂素類(Lignans),黃酮醇類(Flavonol)等幾類。根據(jù)以往的實驗研究和文獻報道發(fā)現(xiàn)不同種類的植物雌激素對成骨細胞均

5、有促增殖與分化的作用,但是綜合比較各類植物雌激素對成骨細胞作用方面的研究目前還沒有人報道,本實驗采用體外培養(yǎng)成骨細胞的方法,觀察不同種類的植物雌激素對成骨細胞增殖與分化的影響;采用RT-PCR的技術,檢測各類植物雌激素對成骨細胞分泌的Ⅰ型膠原COLⅠ mRNA,細胞內(nèi)TGF-β信號轉(zhuǎn)導分子smad4 mRNA和核結合因子runx2 mRNA表達的影響,在細胞水平比較各類植物雌激素對成骨細胞作用的強弱,以及其在分子水平作用機制的異同,以期

6、為抗骨質(zhì)疏松新藥的篩選、研發(fā)以及聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1采用改良的組織塊法分離培養(yǎng)新生(24 h內(nèi))SD大鼠顱骨成骨細胞。將不同濃度的四類植物雌激素(10-9 mol/L和10-7mol/L)加入到培養(yǎng)成骨細胞的培養(yǎng)基中,用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和數(shù)量的改變。
　　 2采用噻唑藍比色(MTT)法,以雌二醇(estrogen,E2)為陽性對照組,檢測加藥后,不同濃度的四類植物雌激素12 h,2

7、4 h,36 h對大鼠成骨細胞增殖的影響。
　　 3采用對硝基苯二鈉基質(zhì)動力學法(pNPP)法,以雌二醇為陽性對照組,檢測不同濃度的四類植物雌激素在24 h,48 h,72 h對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。
　　 4采用放射免疫法(RIA)法,以雌二醇為陽性對照組,檢測不同濃度的四類植物雌激素在24 h,48 h和72 h對大鼠成骨細胞骨鈣素(BGP)水平的影響。
　　 5采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(

8、reverse transcriptase PCR,RT-PCR)方法,檢測大鼠成骨細胞在含10-7mol/L濃度的各類植物雌激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后對Ⅰ型膠原(COLⅠ)mRNA,smad4 mRNA,runx2 mRNA的表達的影響。
　　 結果:
　　 1陽性對照組雌二醇對大鼠成骨細胞增殖與分化的影響
　　 1.1陽性對照組雌二醇細胞形態(tài)學觀察
　　 剛接種的成骨細胞成球形,懸浮于培養(yǎng)液中,逐漸沉

9、降貼壁,24 h細胞貼壁展開。展開細胞形態(tài)不規(guī)則,呈多角形,培養(yǎng)72 h～96 h,細胞為長梭形、條索狀,融合成片,分界較為模糊。培養(yǎng)96 h～120 h,細胞呈鋪路石狀態(tài)。如果再繼續(xù)培養(yǎng),細胞逐漸聚集形成細胞小結,隨后膠原堆積,鈣鹽沉積,形成不透光的礦化結節(jié)。連續(xù)培養(yǎng)20代,可見細胞體積增大,胞質(zhì)稀薄,細胞分裂速度下降等一系列細胞衰老的表現(xiàn)。雌激素組與空白對照組相比,在72 h～96 h時,細胞更加密集,細胞間隙少,形態(tài)無明顯差異。<

10、br>　　 1.2陽性對照組雌二醇對大鼠成骨細胞增殖的影響
　　 大鼠成骨細胞在含有不同濃度雌二醇的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。濃度為1×10-7 mol/L時,培養(yǎng)24 h時有促增殖作用(P＜0.01);濃度為1×10-9 mol/L時,12 h、24 h有促進大鼠成骨細胞增殖作用,其中12 h較為明顯(P＜0.01)。
　　 1.3陽性對照組雌二醇對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響
　　 大鼠成骨細胞在含有不同濃度

11、雌二醇的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h,48 h,72 h,雌二醇組1×10-7 mol/L,1×10-9mol/L兩個濃度組沒有提高大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性的作用(P＞0.05)。
　　 1.4雌二醇組對大鼠成骨細胞分泌骨鈣素(BGP)水平的影響
　　 大鼠成骨細胞在含有不同濃度雌二醇的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),在1×10-7mol/L濃度時:48 h、72 h時,成骨細胞分泌骨鈣素水平與空白組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.

12、05);濃度為1×10-9mol/L時:24 h、72 h時,成骨細胞分泌骨鈣素水平與空白組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2四類植物雌激素組對大鼠成骨細胞增殖與分化的影響
　　 2.1四類植物雌激素組細胞形態(tài)學觀察與雌二醇組類似。
　　 2.2四類植物雌激素對大鼠成骨細胞增殖的影響
　　 大鼠成骨細胞分別在含補骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L

13、),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9mol/L)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)后與空白組比較。當植物雌激素的濃度為10-7 mol/L時:12 h,大豆苷元和補骨脂素與空白組相比有促增殖作用;24 h,大豆苷元,補骨脂素,山奈酚與空白組相比有促增殖作用;36 h,五味子甲素與空白組相比有促增殖的作用。當植物雌激素的濃度10-9 mol/L時:12 h,五味子甲素,補骨脂素與空白組相比有促增殖作用;24

14、h,補骨脂素與空白組相比有促增殖的作用;36 h,大豆苷元,五味子甲素,補骨脂素,山奈酚與空白組相比有促增殖作用。
　　 2.3四類植物雌激素對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響
　　 大鼠成骨細胞分別在含補骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9 mol/L)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)后與空白組比較。當植

15、物雌激素的濃度為10-7 mol/L時:24 h,五味子甲素與空白組相比較能提高堿性磷酸酶的活性;48 h,五味子甲素能提高堿性磷酸酶的活性;72 h,山奈酚和大豆苷元能提高堿性磷酸酶的活性。當植物雌激素的濃度為10-9 mol/L時:24 h,山奈酚,大豆苷元和五味子甲素能提高堿性磷酸酶的活性;48 h,大豆苷元,五味子甲素,補骨脂素,山奈酚能提高堿性磷酸酶的活性;72 h,山奈酚,五味子甲素能提高堿性磷酸酶的活性。
　　 結

16、論:
　　 1從細胞水平上來看四類植物雌激素均對大鼠成骨細胞有促增殖與分化的作用,但是對大鼠成骨細胞影響的階段和起效的時間不相同。
　　 2在增殖實驗中,五味子甲素和補骨脂素的效果優(yōu)于大豆苷元和山奈酚;在分化實驗中,五味子甲素和山奈酚對分化早期指標堿性磷酸酶的效果較其它植物雌激素好;五味子甲素和補骨脂素對于分化晚期指標骨鈣素的效果較其它種類植物雌激素好。
　　 3在細胞水平比較,總體來看補骨脂素和五味子甲素優(yōu)于大

17、豆苷元(大豆異黃酮之一),甚至接近或超過雌激素。這對防治骨質(zhì)疏松化合物的篩選及研發(fā)有重要意義。
　　 4在分子水平研究發(fā)現(xiàn)各類植物雌激素影響的細胞因子不相同,反映了植物雌激素作用于成骨細胞的多途徑性。
　　 5在分子水平的研究發(fā)現(xiàn):大豆苷元對成骨細胞的作用影響的是Ⅰ型膠原COLⅠ mRNA的分泌,在這方面它優(yōu)于其它類植物雌激素;補骨脂素主要影響的是smad4途徑;山奈酚,五味子甲素,大豆苷元都對Runx2/Cbfa1 m