雌激素作用下縫隙連接細(xì)胞間通訊對成骨細(xì)胞作用的研究.pdf

1、背景:
　　雌激素在骨改建中發(fā)揮重要作用，雌激素缺乏可以引起全身性骨質(zhì)疏松。雌激素通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和抑制破骨細(xì)胞活性促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，以增加骨量。相鄰細(xì)胞間縫隙連接蛋白構(gòu)成的縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間信號通路，使骨骼細(xì)胞在接受胞外刺激后產(chǎn)生的信號分子在相關(guān)細(xì)胞中迅速傳遞，使相關(guān)細(xì)胞群形成一功能整體。前期實(shí)驗(yàn)對MC3T3-E1細(xì)胞施加10-8mol/L17-β雌二醇作用5d后，應(yīng)用全基因組基因芯片分析發(fā)現(xiàn)縫隙連接信號通路Gja1

2、因子表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示縫隙連接可能在成骨細(xì)胞對雌激素反應(yīng)的信號調(diào)控中起重要作用。因此，探討雌激素作用下縫隙連接細(xì)胞間通訊對成骨細(xì)胞作用機(jī)制，可以為提高骨創(chuàng)傷修復(fù)質(zhì)量及牙槽骨改建塑形以及相關(guān)骨疾病的治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上通過18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinicacid，AGA)抑制縫隙連接信號通路中的關(guān)鍵因子縫隙連接蛋白43，結(jié)合MTT、ALP、礦化結(jié)節(jié)染色、鈣離子濃度測

3、定、Runx2蛋白和mRNA測定，探討雌激素作用下縫隙連接細(xì)胞間通訊對成骨細(xì)胞作用機(jī)制，并針對這個(gè)機(jī)制和過程采取更有效的應(yīng)對策略，為提高骨創(chuàng)傷修復(fù)質(zhì)量及牙槽骨改建塑形以及相關(guān)骨疾病的治療開辟新的更廣闊的前景。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為四組即:空白對照組;AGA組(30μmol/L);17-β雌二醇(10-8mol/L);17-β雌二醇(10-8mol/L)+AGA組（30μmol/L）。

4、
　　2.應(yīng)用MTT法和ALP法分別檢測四組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后的增殖能力及細(xì)胞分化活性。
　　3.茜素紅染色及鈣離子濃度測定四組細(xì)胞分化成骨能力。
　　4.運(yùn)用RT-PCR及免疫印記Westernblot檢測四組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后的Runx2蛋白及mRNA表達(dá)水平。
　　5.采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1.MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞生長狀況良好。
　　2.細(xì)胞增殖情

5、況:17-β雌二醇組與空白對照組相比，細(xì)胞增殖活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);加入AGA后，不論是17-β雌二醇組，還是非17-β雌二醇組，細(xì)胞增殖活性均明顯降低(P＜0.05)。
　　3.細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)情況:3天組:與空白對照組相比，17-β雌二醇可增加MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性(P＜0.05)，而5天組，17-β雌二醇增加MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性的作用不明顯(P＞0.05);加入AGA后，不論

6、是3天組，還是5天組，細(xì)胞增殖活性均明顯降低(P＜0.05);5天組與3天組相比，隨時(shí)間延長，各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色:肉眼及倒置相差顯微鏡下可見，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量:17-β雌二醇組＞空白對照組＞17-β雌二醇+AGA組＞AGA組。
　　鈣離子濃度:17-β雌二醇組＞空白對照組，17-β雌二醇+AGA組＞AGA組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);加入AGA后，

7、不論17-β雌二醇組，還是非17-β雌二醇組，鈣離子濃度均明顯降低(P＜0.05)。
　　5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測成骨分化相關(guān)基因Runx2mRNA表達(dá)水平:結(jié)果顯示，加入AGA后，不論是在17-β雌二醇下，還是空白對照組，Runx2mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05);17-β雌二醇組與空白對照組相比，Runx2mRNA表達(dá)上調(diào)約1.2倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;17-β雌二醇+AGA聯(lián)合刺激組與僅AGA刺激組相

8、比，Runx2mRNA表達(dá)增加上調(diào)兩倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.Runx2蛋白表達(dá)情況:加入AGA后，不論是否在17-β雌二醇作用下，Runx2蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）;17-β雌二醇組與空白對照組相比，Runx2蛋白表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);17-β雌二醇+AGA聯(lián)合刺激組與僅加入AGA刺激組相比，Runx2蛋白表達(dá)量上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
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