他汀類藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞縫隙連接通訊的作用的研究.pdf

1、縫隙連接(gap junction)是溝通相鄰細(xì)胞間離子及小分子物質(zhì)交換的直接通道，縫隙連接對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育等生命活動(dòng)中起著重要作用。他汀類藥物，即3-羥3-甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑[3-hydroxy-3-methylglutaryl-cooenzymeA(HMG-CoA)reductase inbjbitors]，是臨床上廣泛應(yīng)用的血脂調(diào)節(jié)藥物，許多臨床試驗(yàn)表明，他汀類藥物在一、二級(jí)預(yù)防中明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)

2、生率和死亡率。大量研究表明他汀類藥物還具有多種非降脂作用。有研究表明，他汀類藥物可以抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，近來(lái)有研究顯示，他汀類藥物可以減少小鼠及兔動(dòng)脈粥樣硬化病變中縫隙連接蛋白CX43和Cx40的表達(dá)，但是他汀類藥物對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 第一部分：洛伐他汀對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞縫隙連接胞間通訊功能的影響
　　 目的：
　　 探討洛伐他汀對(duì)大鼠的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移和縫隙連接介導(dǎo)

3、的胞間通訊的影響，闡明縫隙連接胞間通訊在細(xì)胞遷移中的重要作用及他汀抑制平滑肌細(xì)胞遷移的可能機(jī)理之一。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)：取大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞按組織片貼壁法培養(yǎng)。
　　 2、大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞靜默處理后，利用Transwell小室(Transwells assay)分別在無(wú)血清培養(yǎng)基(正常對(duì)照組)和含0.08，0.4，2，or10umol/L洛伐他汀無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，評(píng)估細(xì)胞的遷移情況。

4、>　　 3、大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基(正常對(duì)照組)和含0.08，0.4，2，or10umol/L洛伐他汀無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，利用光漂白恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP)測(cè)定GJIC水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、Transwell小室測(cè)洛伐他汀對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的作用情況的研究，結(jié)果顯示：洛伐他汀對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用呈濃度依

5、賴性；在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)Transwell膜底面的遷移細(xì)胞，正常對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為110±26，加入0.08mmol/L洛伐他汀組為85±31(P>0.05)，加入0.4mmol/L洛伐他汀組為72±24(P<0.05)，加入2mmol/L洛伐他汀組為62±18(P<0.01)，加入10mmol/L洛伐他汀組為58±19(P<0.01)。
　　 2、FRAP方法研究大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞GJIC功能變化，結(jié)果顯示：熒光染色大鼠

6、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，正常對(duì)照組中，經(jīng)瞬間漂白后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?，隨著時(shí)間的推移，熒光逐漸恢復(fù)，至第5min時(shí)，可見(jiàn)熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù)，平均熒光恢復(fù)率為36.11％±10.53％，不同濃度的洛伐他汀(0.08mmol/L，0.4mmol/L，2mmol/L，10mmol/L)作用于大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞48小時(shí)后，明顯降低細(xì)胞的熒光恢復(fù)率，其熒光恢復(fù)率分別為30.20±7.63(P>0.05)，27.01±6.60(P<0.

7、05)，25.95±7.74(P<0.01)，和24.38％±4.84％(P<0.01)，且呈濃度依賴關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1、洛伐他汀可抑制大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移，其作用呈濃度依賴性；
　　 2、本研究首次采用FRAP技術(shù)從功能上證明洛伐他汀可抑制大鼠平滑肌細(xì)胞的縫隙連接胞間通訊；
　　 3、洛伐他汀抑制細(xì)胞間通訊作用可能是抑制細(xì)胞遷移的機(jī)制之一。
　　 第二部分：他汀藥物對(duì)兔主動(dòng)脈平滑

8、肌細(xì)胞縫隙連接通訊的抑制作用
　　 目的：
　　 探討洛伐他汀和普伐他汀對(duì)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移和縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的影響，比較水溶性他汀藥物與脂溶性藥物的作用，闡明縫隙連接胞間通訊在細(xì)胞遷移中的重要作用及他汀抑制平滑肌細(xì)胞遷移的可能機(jī)理之一。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)：取家兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞按酶消化法方法培養(yǎng)。
　　 2、兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞靜默處理后，利用Transwell小室(Tr

9、answells assay)分別在無(wú)血清培養(yǎng)基(正常對(duì)照)以及含0.08，0.4，2，or10umol/L洛伐他汀或普伐他汀的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，評(píng)估細(xì)胞的遷移情況。
　　 3、兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基(正常對(duì)照)含0.08，0.4，2，or10umol/L洛伐他汀培或普伐他汀的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，利用光漂白恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RA

10、P)測(cè)定GJIC水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、洛伐他汀和普伐他汀均可明顯抑制兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力，10mmol/L洛伐他汀和普伐他汀作用下，在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)Transwell膜底面的遷移細(xì)胞分別為43±7和81±15，而正常對(duì)照為120±27；
　　 2、洛伐他汀和普伐他汀均可明顯抑制兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的縫隙連接通訊功能，10mmol/L洛伐他汀和普伐他汀作用下，兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的熒光恢復(fù)率分別

11、為17.83％±6.49％and29.54％±8.13％，而正常對(duì)照為53.4％±13.84％；
　　 3、在2mmol/L和10mmol/L的濃度下，脂溶性的洛伐他汀對(duì)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移能力和縫隙連接通訊功能的抑制作用強(qiáng)于水溶性的普伐他汀(P<0.05)
　　 結(jié)論：
　　 1、他汀藥物可抑制兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移能力和縫隙連接通訊功能，其作用呈濃度依賴性；
　　 2、脂溶性他汀藥物(洛伐他汀)對(duì)兔