他汀類藥物抑制腦血管平滑肌細胞增殖及其與容積調節(jié)性氯通道的關系.pdf

1、腦卒中是最常見的腦血管疾病，是人類死亡的三大因素之一。已經(jīng)確認高血壓是導致腦卒中的重要危險因素之一。高血壓發(fā)展過程中出現(xiàn)的血管重構是引起腦卒中、心肌梗死等高血壓并發(fā)癥的病理基礎，形態(tài)學上主要表現(xiàn)為管徑變細、管壁增厚。其中平滑肌細胞的增殖被經(jīng)典地認為是腦血管重構的重要因素，有研究顯示在高血壓過程中，VSMC復制增加而相應的細胞凋亡沒有增加，從而導致動脈和小動脈中膜層的增厚。 他汀類藥物，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，體內實驗已經(jīng)

2、證明他汀類藥物具有“多效性”的作用，包括改善內皮功能、抗氧化、增加NO合成、降低炎癥和平滑肌細胞增殖。這些效應的作用機制可能與膽固醇合成的重要中間產(chǎn)物FPP和GGPP有關，這些類異戊二烯分子作為脂性基團與轉錄后的一些信號蛋白分子如Ras，Rho共價結合后使之活化，從而激活其下游信號分子。許多研究表明活化的Rho蛋白參與了血管的許多重要的生理和病理過程，包括平滑肌收縮、細胞增殖、遷移和炎癥反應。然而他汀類藥物抑制增殖的機制還不十分清楚。

3、 本課題在原代培養(yǎng)的大鼠基底動脈平滑肌細胞上觀察simvastatin對ET-1和低滲培養(yǎng)基誘導平滑肌細胞增殖的抑制作用及其與VRCC的關系。 第1章simvastatin對ET-1和低滲培養(yǎng)基誘導的平滑肌細胞增殖的影響 采用CCK-8和BrdU摻入實驗及細胞記數(shù)法檢測simvastatin對ET-1和低滲培養(yǎng)基誘導平滑肌細胞增殖的作用及其調節(jié)機制。結果表明： 1.10-8MET-1可引起B(yǎng)ASMCs增殖，用

4、CCK-8法檢測在450nm處的吸光度反應細胞活力，三組與對照相比都有顯著性差異。在48小時時間點ET-1增殖率最高。 2.25％低滲培養(yǎng)基孵育BASMCs3h，6h，12h，24h，48h，50％低滲培養(yǎng)基孵育BASMCs12h后用CCK-8法檢測細胞活力，25％低滲培養(yǎng)基孵育6h，12h，24h后的細胞活力都與對照組有顯著性差異，并以24h作用為最好。25％低滲培養(yǎng)基作用48h，50％低滲培養(yǎng)基作用12h反而使細胞活力比對照

5、降低。 3.simvastatin濃度依賴性的抑制10-8MET-1誘導的BASMCs的增殖。 4.simvastatin濃度依賴性的抑制低滲培養(yǎng)基誘導的BASMCs的增殖，以對照組為100％，則BrdU摻入實驗顯示低滲培養(yǎng)基處理組。 5.20μMsimvastatin完全抑制10-8MET-1誘導的BASMCs的增殖。在培養(yǎng)基中同時加入100μM甲羥戊酸，10μMGGPP可以完全逆轉simvastatin的作用

6、。10μMFPP只能部分逆轉simvastatin的作用，增殖百分數(shù)為110.2±3.7％，與單獨ET-1處理組和對照組之間都有顯著性差異。 6.20μMsimvastatin完全抑制25％低滲培養(yǎng)基誘導的BASMCs的增殖。在培養(yǎng)基中同時加入100μM甲羥戊酸，10μMGGPP可以完全逆轉simvastatin的作用。10μMFPP只能部分逆轉simvastatin的作用，與對照組之間沒有顯著性差異。 小結：

7、1.10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基都可以誘導BASMCs增殖。 2.simvastatin可以濃度依賴性地抑制10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導的BASMCs增殖。 3.simvastatin的抑制效應可以被100μMMVA，10μMGGPP完全逆轉，10μMFPP只能部分逆轉此效應。100μM膽固醇完全不能逆轉simvastatin的效應。0.25μg/mlC3和10μMY-27632可以模擬simvast

8、atin的效應。 第2章simvastatin對容積調節(jié)性氯通道的作用及其調節(jié)機制 采用單細胞熒光影像分析系統(tǒng)和膜片鉗技術分析simvastatin對VRCC的影響及其調節(jié)機制。結果表明： 1.細胞外灌流液由310mosmol/kg·H2O轉換為230mosmol/kg·H2O低滲溶液后，可引起B(yǎng)ASMCs細胞內氯離子的外流，經(jīng)校正后等滲和低滲細胞內氯離子濃度分別為31.0±1.3mM和21.8±1.4mM，細胞

9、內氯離子降低比率為29.6±4.6％. 2.simvastatin濃度依賴性地抑制低滲誘導的氯離子的外流。simvastatin2.5，5，10，20μM等滲預敷細胞5分鐘后，換成低滲細胞外液灌流細胞。 3.細胞外灌流液中預先加入100μMMVA或10μMGGPP，5分鐘后再加入20μMsimvastatin可以完全阻斷simvastatin抑制氯離子外流的作用，與對照組低滲情況下胞內氯離子濃度無顯著性差異。10μMFP

10、P只能部分阻止simvastatin的效應，低滲細胞內氯離子濃度為26.3±0.7mM，與對照組和simvastatin組低滲情況下胞內氯離子濃度相比都有顯著性差異。 4.0.25μg/mlC3預孵細胞4小時后，BASMCs由等滲換成低滲溶液灌流。 5.細胞外低滲溶液刺激下，BASMCs胞漿氯離子濃度從靜息時的31.7±2.5mM降低到21.0±1.5mM，接著應用10μMY-27632能部分抑制低滲誘發(fā)的氯離子外流，抑

11、制率為20.1±6.9％。 6.在等滲細胞外液中直接加入ET-1不能直接激活氯離子的外流。10-8MET-1孵育細胞48小時后，灌注低滲溶液。 7.低滲溶液引起B(yǎng)ASMCs明顯腫脹，隨后激活一氯離子依賴性外向整流電流。該電流在正電位時緩慢失活。在胞內外氯離子濃度相等條件下其反轉電位接近氯離子平衡電位。 8.simvastatin濃度依賴性地抑制Icl,vol，20μMsimvastatin預孵細胞5分鐘達到最大抑

12、制效應。該抑制效應沒有電壓依賴性。 9.100μMMVA和10μMGGPP預孵細胞可完全逆轉simvastatin的抑制Icl，vol效應。 10.電極內液孵育10μMY-27632顯著降低低滲激活的Icl,vol。抑制效應沒有電壓依賴性。 小結： 1.在BASMCs上單細胞測細胞內氯離子濃度和膜片鉗技術都顯示simvastatin能濃度依賴性地抑制低滲誘導的氯離子外流和Icl,vol。 2.si

13、mvastatin的抑制效應可以被100μMMVA，10μMGGPP完全逆轉，10μMFPP只能部分逆轉此效應。 3.0.25μg/mlC3預孵細胞4小時可明顯減低低滲誘導的氯離子外流，而低滲誘導VRCC開放后再給予10μMY-27632僅微弱抑制氯離子外流。 4.10μMY-27632電極內液給藥，能模擬simvastatin的效應，抑制低滲細胞外液誘導的Icl,vol。 5.等滲情況下直接應用ET-1不能激活

14、胞內氯離子的外流，而當ET-1預孵細胞48h后，在給予低滲細胞外液的情況下，可以加大氯離子外流的幅度。 第3部分VRCC在simvastatin抑制BASMCs增殖中的作用 通過在BASMCs上轉染豚鼠心室肌ClC-3cDNA全長，采用BrdU摻入實驗觀察ClC-3對simvastatin抑制細胞增殖的影響。并且通過simvastatin抑制增殖和抑制氯運動IC50值以及相關性的分析，闡述兩者之間的相互作用。結果如下：

15、 1.BASMCs轉染CIC-3cDNA后，10-8MET-1誘導的增殖率由未轉染的129.5±3.0％增加到143.7±2.7％，兩者之間有顯著性差異。 2.simvastatin能濃度依賴性地抑制10μMET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導的轉染CIC-3BASMCs的增殖，但抑制率較未轉染細胞明顯降低。 3.simvastatin抑制10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導的未轉染ClC-3BASMCs增殖的IC5

16、0值分別為3.2±0.04和3.4±0.50M，而轉染ClC-3后的IC50值分別為5.3±0.7和5.6±0.7μM，兩者之間有顯著性差異。 4.simvastatin抑制氯離子外流的IC50值為3.7±0.2μM，與其抑制細胞增殖的IC50值相近。 5.對simvastatin抑制10-8MET-1誘導的細胞增殖和抑制低滲誘導的氯離子外流之間進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)兩者成正相關，相關系數(shù)為0.94。simvastatin

17、抑制25％低滲培養(yǎng)基誘導的細胞增殖和抑制低滲誘導的氯離子外流之間也呈正相關，相關系數(shù)為0.84。 小結： 1.轉染ClC-3后simvastatin對10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導的增殖的抑制作用減弱。量效曲線右移。 2.simvastatin抑制氯離子外流和抑制增殖的IC50值相近，且之間有強的正相關性。 結論： 1.Simvastatin能濃度依賴性地抑制ET-1或低滲溶液誘導的BA