他汀類藥物與抗氧化藥物對血管平滑肌細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化是一個全身性的病理過程，可導(dǎo)致動脈狹窄甚至閉塞，是造成心肌梗死、腦卒中和周圍血管慢性缺血性疾病的首要病因。經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)與支架植入術(shù)是目前治療動脈狹窄/閉塞性疾病的常用方法，然而，術(shù)后數(shù)月內(nèi)血管往往會再狹窄甚至再閉塞，因此其遠期療效仍然未盡如人意。
　　血管平滑肌細胞(VSMC)的異常增殖和遷移被認為與動脈粥樣硬化和支架植入術(shù)后再狹窄有關(guān)，而表型轉(zhuǎn)換是活化的VSMC發(fā)生上述生物學(xué)行為改變的基礎(chǔ)。因此，預(yù)防和延緩VS

2、MC的異常增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，對防治動脈粥樣硬化和支架術(shù)后再狹窄意義重大。
　　臨床上，他汀類藥物和抗氧化藥物常用于防治上述疾病。他汀類藥物通過抑制VSMC增殖并從誘導(dǎo)其凋亡，可抑制血管成形術(shù)后內(nèi)膜增生，故除用于降低血脂外，已作為一種抑制內(nèi)膜增生的藥物廣泛應(yīng)用于臨床。而普羅布考等抗氧化藥物是一種新型的抗動脈粥樣硬化藥物，與VSMC的生物學(xué)行為的關(guān)系目前仍未完全明確，因此有必要探明他汀類藥物和普羅布考對其生物學(xué)行為的影響，并比較兩

3、者的異同。
　　本課題將使用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)分別誘導(dǎo)大鼠VSMC發(fā)生增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，其后給予不同濃度的阿托伐他汀、普羅布考或兩者聯(lián)用，觀察這兩種藥物對VSMC上述生物學(xué)行為的影響，并比較兩者單用及聯(lián)用時效應(yīng)的異同和強弱，為今后臨床用藥提供依據(jù)和參考方案。
　　第一部分血管平滑肌細胞的分離與培養(yǎng)
　　目的
　　從健康雄性SD大鼠胸腹主動脈中分離、培養(yǎng)及鑒定中膜VSMC，建立簡單有效的原代VSMC

4、培養(yǎng)體系。
　　方法
　　無菌條件下取出健康雄性SD大鼠胸腹主動脈，去除外膜及內(nèi)膜后，采用組織貼塊法分離和培養(yǎng)中膜VSMC，并適時傳代、凍存和復(fù)蘇。通過倒置顯微鏡連續(xù)觀察細胞生長情況，臺盼藍染色檢測細胞活力，免疫細胞化學(xué)染色鑒定細胞純度。
　　結(jié)果
　　在貼塊后4d-7d，原代細胞從小組織塊周圍萌出，隨后的10d-14d細胞逐漸遷出和生長，最終融合成致密的細胞層，從貼塊到原代細胞傳代的時間為2w-3w。多數(shù)原代V

5、SMC表現(xiàn)為典型的長梭形或三角形，胞漿豐富，生長至融合狀態(tài)時呈現(xiàn)出“峰谷”樣排列，傳代后的VSMC形態(tài)和排列與原代細胞保持一致。臺盼藍染色示細胞活力為96.3％±1.8％。SMα-Actin染色陽性的VSMC百分比為95.4％±2.7％。
　　結(jié)論
　　通過組織貼塊法，可在體外成功分離獲得正常大鼠主動脈中膜VSMC，其中絕大多數(shù)是收縮型細胞，而且活力好，純度高，可用于研究VSMC的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等生物學(xué)行為。
　

6、　第二部分他汀類藥物與抗氧化藥物對血管平滑肌細胞增殖的影響
　　目的
　　觀察他汀類藥物和抗氧化藥物對VSMC增殖的影響，評估兩者單用及聯(lián)用時的影響程度差異，并根據(jù)實驗結(jié)果，確定阿托伐他汀和普羅布考的最佳作用濃度。
　　方法
　　用MTT比色法評估阿托伐他汀在0.1μmol/L-10μmol/L、普羅布考在1μmol/L-100μmol/L的濃度范圍內(nèi)，分別單用和聯(lián)用時的細胞毒性。以oxLDL刺激VSMC，在上述

7、濃度下分別單用和聯(lián)用阿托伐他汀和普羅布考，比較各組VSMC的吸光值。
　　結(jié)果
　　在上述濃度下，阿托伐他汀(P=0.214)、普羅布考（P=0.547）和兩藥聯(lián)用（P=0.999）對VSMC沒有細胞毒性作用。oxLDL能誘導(dǎo)VSMC增殖，使吸光度升高，而單用普羅布考(P＜0.001)和兩藥聯(lián)用（P=0.001）可降低VSMC吸光值。阿托伐他汀和普羅布考分別在10μmol/L和100μmol/L時，對VSMC的作用最顯著。<

8、br>　　結(jié)論
　　單用普羅布考及聯(lián)用阿托伐他汀與普羅布考均可顯著抑制VSMC的增殖，且這一抑制作用是劑量依賴性的。單用阿托伐他汀能否抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖活動，需要更大樣本量的實驗證實。
　　第三部分他汀類藥物與抗氧化藥物對血管平滑肌細胞遷移的影響
　　目的
　　觀察他汀類藥物和抗氧化藥物對VSMC遷移的影響，并評估兩者單用及聯(lián)用時的影響程度差異。
　　方法
　　以oxLDL刺激VSMC后

9、，分別單用和聯(lián)用阿托伐他汀(10μmol/L)和普羅布考(100μmol/L)，其后在熒光顯微鏡下觀察對照組、oxLDL組、阿托伐他汀組、普羅布考組和阿托伐他汀+普羅布考組VSMC的遷移情況，并拍照記錄，計算各照片中VSMC遷移進入刮除區(qū)后在刮除區(qū)所占的面積百分比，以進行細胞平面遷移分析。
　　結(jié)果
　　對照組遷移VSMC占細胞刮除區(qū)內(nèi)面積的百分比為5.80％±2.85％，oxLDL組為17.42％±9.97％，阿托伐他汀組

10、為9.68％±2.65％，普羅布考組為11.84％±5.14％，阿托伐他汀+普羅布考組為5.28％±2.24％。對照組與oxLDL組之間（P=0.004）及阿托伐他汀+普羅布考組與oxLDL組之間(P=0.002)有顯著性差異，其余各對比較無顯著性差異。
　　結(jié)論
　　聯(lián)用阿托伐他汀和普羅布考可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC的遷移行為。大樣本量的研究或可證明單用阿托伐他汀和單用普羅布考是否確能抑制VSMC發(fā)生遷移。

11、　　第四部分他汀類藥物與抗氧化藥物對血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換的影響
　　目的
　　觀察他汀類藥物和抗氧化藥物對VSMC表型轉(zhuǎn)換的影響，并評估兩者單用及聯(lián)用時的影響程度差異。
　　方法
　　以oxLDL刺激VSMC，其后分別使用10μmol/L阿托伐他汀、100μmol/L普羅布考和10μmol/L阿托伐他汀+100μmol/L普羅布考，通過透射電子顯微鏡觀察各組VSMC的形態(tài)，免疫組織化學(xué)、Western Blot

12、和Real time PCR法檢測各組細胞的VSMC表型蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達情況。
　　結(jié)果
　　與對照組相比，oxLDL組VSMC肌絲大量減少甚至消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器增多和擴張，線粒體也增多;阿托伐他汀組、普羅布考組和阿托伐他汀+普羅布考組VSMC的肌絲多于oxLDL組但少于對照組，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則少于oxLDL組VSMC。oxLDL組VSMC的SMα-Actin、SM-MHC和Smoothelin的表達量在蛋白水平和