同型半胱氨酸對人血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)特性影響及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 目的：建立人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)體外培養(yǎng)模型。 方法：運(yùn)用改良的植塊貼壁法體外培養(yǎng)VSMCs；在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行α-actin免疫組化鑒定。 結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞生長良好，光鏡下呈長梭形及“峰與谷”樣生長。α-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的VSMCs特征。 結(jié)論：改良植塊貼壁法能使VSMCs原代培養(yǎng)的時(shí)間

2、明顯縮短，傳代后VSMCs生物學(xué)特征的穩(wěn)定性好，成功建立了人血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)體外培養(yǎng)模型。 第二部分同型半胱氨酸對人血管平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布及cyclinA、cyclinB1表達(dá)影響 目的：觀察同型半胱氨酸(Hcy)對人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖的影響，并探討其機(jī)制。 方法：采用MTT方法檢測Hcy誘導(dǎo)VSMCs增殖情況；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；采用RT-PCR方法檢測細(xì)胞周

3、期蛋白A(cyclinA)和細(xì)胞周期蛋白B1(cyclinB1)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的A值均高于對照組(P＜0.05)，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCs增殖； 2、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的S期細(xì)胞百

4、分?jǐn)?shù)分別為12.2％、17.0％、24.2％、32.8％、41.4％，表明Hcy能增加VSMCsS期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)； 3、體外培養(yǎng)的人VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的cyclinAmRNA相對表達(dá)量分別為0.66±0.01、0.79±0.04、0.87±0.02、1.07±0.03和1.18±0.04，cyclinB1mRNA相對表達(dá)量分別為0.55±0.0

5、2、0.68±0.02、0.89±0.05、1.28±0.01和1.41±0.02，表明Hcy呈濃度依賴性顯著誘導(dǎo)人VSMCscyclinA和cyclinB1基因的表達(dá)。 結(jié)論：1、Hcy可以誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs增殖，而且呈濃度依賴性； 2、Hcy誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs增殖，使S期VSMCs細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，可能與其誘導(dǎo)cyclinA和cyclinB1基因表達(dá)有關(guān)。 第三部分同型半胱氨酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞凋亡

6、及其機(jī)制探討 目的：研究同型半胱氨酸(Hcy)對人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)凋亡的影響，并探討其機(jī)制。 方法：用透射電鏡觀察經(jīng)Hcy誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs凋亡的形態(tài)學(xué)改變；用瓊脂糖凝膠電泳測定DNAladder；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；采用RT-PCR檢測bcl-2、bax及caspase-3mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果：1、200-1000μmol/L濃度Hcy能明顯誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs凋亡，產(chǎn)生凋

7、亡細(xì)胞所具有的典型形態(tài)學(xué)及生化特征； 2、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的細(xì)胞凋亡率分別2.68％±0.23％、2.79％±0.12％、8.45％±2.41％、13.37％±4.71％、23.75％±5.56％，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCs細(xì)胞凋亡； 3、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、20

8、0、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的baxmRNA相對表達(dá)量分別為0.86±0.01、0.92±0.03、1.51±0.02、1.82±0.03、1.91±0.02，bcl-2mRNA相對表達(dá)量分別為1.38±0.04、1.32±0.03、1.28±0.03、1.21±0.02、1.09±0.02，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCsbax基因表達(dá)顯著上調(diào)，bcl-2基因表達(dá)輕度下調(diào)，bax/bcl-2比值升

9、高； 4、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的caspase-3mRNA相對表達(dá)量分別為0.24±0.08、0.29±0.10、0.89±0.26、1.37±0.24、1.82±0.53，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCscaspase-3基因表達(dá)顯著上調(diào)。 結(jié)論： 1、Hcy可誘導(dǎo)人VSMCs凋亡，其作用呈劑量相關(guān)性；

10、 2、Hcy誘導(dǎo)人VSMCs凋亡的機(jī)制可能是通過下調(diào)bcl-2基因表達(dá)及上調(diào)bax基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，此外，caspases-3也可能參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。 第四部分同型半胱氨酸對人血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)組織因子途徑抑制物-2的影響 目的：觀察同型半胱氨酸(Hcy)對人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)表達(dá)組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)的影響。 方法：采用RT-PCR方法檢測Hcy對人VSMCsTFP

11、I-2mRNA表達(dá)的變化；采用WesternBlot方法檢測Hcy對人VSMCsTFPI-2蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：1、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的TFPI-2mRNA相對表達(dá)量分別為0.96±0.07、0.86±0.05、0.73±0.07、0.56±0.04和0.45±0.07，表明Hcy呈濃度依賴性抑制人VSMCsTFPI-2

12、基因的表達(dá)； 2、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的TFPI-2蛋白相對表達(dá)量分別為1.22±0.20、1.09±0.12、0.87±0.15、0.71±0.098和0.54±0.183，表明Hcy呈濃度依賴性抑制人VSMCsTFPI-2蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：Hcy以濃度依賴性的方式抑制了人臍動脈VSMCs表達(dá)TFPI-2，提示Hc