富含半胱氨酸蛋白61RNA干擾重組質(zhì)粒抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文利用RNAi技術(shù)建立Cyr61小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)重組質(zhì)粒抑制VSMCs增殖的研究目前在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為此我們構(gòu)建了大鼠Cyr61 siRNA重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染VSMCs中，觀察其對(duì)VSMCs增殖的抑制作用，以期為將來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化及PTCA術(shù)后再狹窄等增生性疾病的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法 1．人工合成針對(duì)靶序列Cyr61基因的兩條寡核苷酸鏈，寡核苷酸鏈兩端加入酶

2、切位點(diǎn)，便于和表達(dá)載體連接。取正反向寡核苷酸鏈，與退火緩沖液混勻，94℃水浴3min,退火自然冷卻至室溫。質(zhì)粒37℃酶切1h，酶切產(chǎn)物電泳，凝膠回收試劑盒回收大片段。退火片段與線性化Pgenesil-1質(zhì)粒表達(dá)載體連接，將連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，含Kanar抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，采用酶切和DNA序列分析進(jìn)行鑒定。構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為pCyr61-shRNA<,1>、pCyr61-shRNA<,2>和p-HK(空質(zhì)

3、粒對(duì)照)。 2．應(yīng)用構(gòu)建的質(zhì)粒pCyr61-shRNA轉(zhuǎn)染大鼠VSMCs，24h后應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)VSMCs中Cyr61的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 3．應(yīng)用構(gòu)建的質(zhì)粒pCyr61-shRNA轉(zhuǎn)染加入Ang Ⅱ刺激的大鼠VSMCS，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；臺(tái)盼藍(lán)染色法和MTT法檢測(cè)VSMCs增殖的變化；<'3>H標(biāo)記胸腺嘧啶摻入法檢測(cè)VSMCs DNA含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；EL

4、ISA法檢測(cè)分泌到細(xì)胞基質(zhì)中的Cyr61蛋白。 結(jié)果 1.構(gòu)建的質(zhì)粒pCyr61-shRNA經(jīng)酶切和DNA測(cè)序證實(shí)了表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2．轉(zhuǎn)染VSMCs 24h后，用熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染效率在60％左右，并能成功表達(dá)出綠色熒光蛋白；轉(zhuǎn)染的pCyr61-shRNA<,1>(0.114±0.012)和pCyr61-shRNA<,2>(0.105±0.010)的mRNA表達(dá)均明顯降低，與正常對(duì)照組(1.256±0.1

5、38)及轉(zhuǎn)染P-HK組(p-HK組)(1.342±0.147)相比有顯著性差異(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染的p-HK組與正常對(duì)照組相比沒(méi)有明顯改變，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；Western-Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的pCyr61-shRNA<,1>組(0.012±0.004)和pCyr61-sbRNA<,2>組(0.009±0.001)的蛋白表達(dá)均明顯降低，與正常對(duì)照組(0.984±0.082)及p-HK組(0.898±0.076)相比有

6、顯著性差異(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染的P-HK組與正常對(duì)照組相比沒(méi)有明顯改變，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3．加入Ang Ⅱ刺激同時(shí)轉(zhuǎn)染VSMCs48h后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，加入Ang Ⅱ刺激同時(shí)轉(zhuǎn)染pCyr61-shRNA<,1>組和pCyr61-shRYA<,2>組細(xì)胞數(shù)(2.031±0.096和2.431±0.765)明顯減少，與正常對(duì)照組和p-HK組(8.234±0.428和9.642±0.465)相比均有顯著

7、性差異(p<0.01)；而正常對(duì)照組和p-HK組相比均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。MTT法VSMCs檢測(cè)增殖結(jié)果顯示，加入AngⅡ刺激同時(shí)轉(zhuǎn)染pCyr61-shRNAl(Ⅲ組)和pCyr61-shRNA<,2>(Ⅵ組)吸光光度值(0.145±0.008和0.175±0.013)明顯降低，與正常對(duì)照組(Ⅰ組)和轉(zhuǎn)染的p-HK組(Ⅱ組)(0.856±0.046和0.876±0.033)相比均有顯著性差異(P<0.01)；而Ⅰ組與Ⅱ組相比均

8、無(wú)顯著性差異(P>0.05)。<'3>H-TDR摻入法檢測(cè)VSMCs DNA合成，結(jié)果表明，加入Ang Ⅱ刺激同時(shí)轉(zhuǎn)染pCyr61-shRNAI(Ⅲ組)和pCyr61-shRNA<,2>(Ⅵ組)吸光光度值為(158.333±11.480和162.000±12.156)明顯降低，與正常對(duì)照組(Ⅰ組)和p-HK(Ⅱ組)(543.000±27.622和536.667±36.866)(相比均有顯著性差異(P<0.01)；而Ⅰ組與Ⅱ組相比均無(wú)顯著

9、性差異(P>0.05)。 4．ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，加入AngⅡ刺激同時(shí)轉(zhuǎn)染pCyr61-shRNAl(ⅢN)和pCyr61-shRMA<,2>(Ⅵ組)Cyr61蛋白明顯降低，與正常對(duì)照組(Ⅰ組)和空質(zhì)粒對(duì)照p-HK(Ⅱ組)相比均有顯著性差異(P<0.01)；而Ⅰ組與Ⅱ組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 5．流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建的cyr61RNA干擾重組質(zhì)?？捎糜赾yr61